中文摘要：

乳腺炎是造成奶业经济损失最大的一种常见病、多发病。乳腺炎抗性分子机制研究一直备受关注，但其中的关键环节尚不明了。可变剪切在疾病和治疗中的作用引起人们广泛的兴趣。基因芯片的研究结果表明患乳腺炎奶牛和健康奶牛的乳腺有许多与免疫相关的差异表达基因，并且存在病原体特异性。基于国际上该领域已有研究和我们课题组新近进展，我们拟提出"患乳腺炎奶牛和健康牛乳腺组织的差异表达基因存在不同的可变剪切和表达模式"的假设，认为与奶牛免疫相关基因可通过不同的剪切和表达模式对乳腺炎抗性发挥重要作用。具体拟采用RT-PCR、cDNA-seq、RACE、Q-PCR、Northern blot、RNAi等技术研究奶牛乳腺组织免疫相关基因的可变剪切模式、表达谱和功能，同时，通过比较基因组学、生物信息学和实验探讨候选基因调控区的分子特性，旨在阐明可变剪切在乳腺炎抗性作用中的部分机制，为奶牛乳腺炎抗性分子育种提供新的科学依据。

结论摘要：

本项目利用高通量测序和生物信息学分析了健康和患乳腺炎奶牛乳腺组织的转录组，对SLAMF7、BOLA-DQA2、Lf、C4A、MBL、CLU、HMGB3、NCF1、A2M等免疫相关基因进行可变剪切模式和表达的分子机制研究（1）利用深度测序技术，在健康和患乳腺炎奶牛乳腺组织分别发现有1317和1093个剪切功能基因属于健康和患乳腺炎奶牛特异的。（2）SLAMF7基因新发现3种可变剪切体，其中，SLAMF7-AS1在金黄色葡萄球菌引起的乳腺炎牛乳腺组织中的表达量显著上调。（3）Lf发现了一种可变剪切体，为乳腺炎奶牛乳腺组织所特有，可能与乳腺炎易感性密切相关。（4）BOLA-DQA2新发现剪切体BOLA-DQA2-SV1，是乳腺组织的主转录本，在患乳腺炎奶牛乳腺中的表达量呈2.67倍上调。其中SNP（c.+1283C>T）位于 bta-miR-2318和BOLA-DQA2基因3’UTR结合区，可影响 bta-miR-2318与靶基因的结合。（5）鉴定了C4A、MBL和CLU基因的核心启动子和关键的调控元件，以及可用于奶牛乳腺炎抗性分子标记的单倍型。CLU的转录本可产生不同的异构体，并且在乳腺组织和上皮细胞差异表达。（6）HMGB3发现两种转录本，在乳腺炎奶牛乳腺组织高表达。利用双荧光素酶报告系统鉴定出HMGB3含有3个启动子，其中P1启动了HMGB3-TV1转录本，P2和P3启动了HMGB3-TV2转录本生成，且基因P3启动子上发现了一个SNP（g.5880C>T）可影响P3启动子活性。（7）iTRAQ发现A2M患乳腺炎组织表达量比正常组织显著上调，共鉴定出23种新的可变剪切体，且证实第29外显子c.3535A>T的突变可导致剪切体A2M-AS4的产生，构建荧光素酶报告系统研究了A2M基因启动子区，鉴定了调控区内部的功能性SNPs。（8）NCF1存在2种剪切体，均属于内含子保留的剪切模式。在健康奶牛和由大肠杆菌引起的乳腺炎奶牛的乳腺组织、血液和嗜中性粒细胞中差异表达。本项目通过转录组测序和候选基因研究策略，证实了我们提出“患乳腺炎奶牛和健康奶牛乳腺组织的差异表达基因存在不同的可变剪切和表达模式，免疫相关基因通过可变剪切机制在乳腺炎抗性中发挥作用”的假设。这为下一步深入开展乳腺炎抗性分子基础和育种研究提供了新的思路。