中文摘要：

溃疡性结肠炎（UC）癌变率高，缺乏预防措施。NF-κB参与UC癌变，由LPS通过TLR4活化NF-κB是UC癌变的重要通路；其中TLR4在细胞膜的表达是该通路被活化的关键。我们发现，5-半乳寡糖醛酸(AOG)具有显著预防UC癌变作用，单独使用可促进TLR4的细胞膜表达，与LPS联合应用则抑制其引起的TLR4在细胞膜的表达，从而竞争性地抑制LPS引起的NF-κB活化，提示TLR4的膜表达是调控NF-κB活性，预防UC癌变的潜在靶点。本课题拟采用RNAi技术分别降低HT-29细胞TLR4及其辅助受体CD14、MD-2表达水平；应用FITC-AOG受体分析方法，观察AOG影响TLR4膜表达的分子靶点；并对其靶分子进行定点突变，研究AOG与其靶分子的结合位点；阐明AOG预防UC癌变的分子机制。为AOG的构-效关系研究奠定基础，为挖掘以TLR4为靶点的UC癌变化学预防药物提供依据。

结论摘要：

在以往的研究基础上，本课题确认AOG对溃疡性结肠炎（UC）癌变的抑制作用并研究其机制。进一步的研究表明苹果多糖可影响LPS/TLR4/NF-κB通路的很多环节，可降低LPS通过TLR4引起的MD2, MyD88, TRAM的水平升高，和IFN-β 和IL-6的水平降低。我们采用RNAi技术沉默TLR4，发现LPS和苹果多糖均不能诱导NF-κB的活化，提示，苹果多糖治疗结肠炎癌变的作用确实通过拮抗LPS作用于TLR4引起的NF-κB活化而实现。苹果多糖可诱导细胞凋亡，且呈剂量依赖性，可通过升高Bax水平，降低Bcl-2和Bcl-xl水平而实现。对细胞周期的研究表明，苹果多糖可促进细胞进入S期，降低Cdk 2和cyclin B1的表达，而不影响cyclin A1。为了确定AOG的作用靶点，我们克隆了TLR4、MD2和CD14 的cDNA ，构建了过表达质粒并在HEK293细胞中得到高效表达；同时设计了TLR4、MD2和CD14基因的shRNAs并构建了慢病毒介导的基因沉默系统。在HEK293过表达细胞中，针对三种基因的shRNAs的沉默效率均达到80%以上，显示针对三种基因的沉默系统构建成功。根据基金的研究计划，为了验证AOG作用体系中重要的蛋白结合位点，课题组对TLR4、CD14所编码的关键氨基酸进行了单点、双点突变和三点突变，共获得10个质粒。该类质粒经测序验证后，转染至HEK293细胞，经western blotting 验证，CD14、TLR4、TLR4-M264、TLR4-M362、TLR4-M341M362、LY96、LY96 m58、LY96 m118、LY96 m122、LY96 m58+118均有显著过表达效果，LY96 m58+122和LY96 m118+122未检测到显著过表达。虽然我们构建的过表达质粒和用于基因沉默质粒在HEK293能够高效表达并达到理想效果，但是我们将构建质粒尝试着转染进入结肠癌细胞株(HT29，SW620,Sw48，GP2D) 时，发现其转染效率均低于10%。因此，下一步研究中我们将着重提高转染效率或者运用新的转染方法，将获得的质粒在结肠癌细胞株进行表达和沉默，继续研究AOG的作用靶点。本项目共发表SCI文章6篇，获得2项国家发明专利的授权,培养硕士生1名，博士生2名，博士后1名。