中文摘要：

本项目拟通过超高灵敏流式检测技术与细菌双杂交系统的有机结合，发展灵敏、快速、高分辨、高通量的蛋白－蛋白相互作用研究新方法。研究蛋白-蛋白相互作用是理解生命活动的基础，作为酵母双杂交的衍生系统，细菌双杂交系统在蛋白－蛋白相互作用的鉴定和分析中具有实验周期短、操作简单、转化率高、假阳性率低、蛋白不需要核定位等优点。单个细菌水平的蛋白－蛋白相互作用研究有助于更准确地考察蛋白在活细胞中的相互作用状况，揭示传统生物化学检测手段中因集权平均而被掩盖的个体差异。研究工作将在实验室自行研制的多通道超高灵敏流式检测仪的基础上开展，建立单个细菌水平蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的定量检测方法，通过对双杂交系统报告细菌的快速、逐一分析，实现蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的单细菌水平定量表征和统计分析，揭示它们之间的定量关系。本项目对于蛋白质功能的准确解析、信号转导通路的确定、及新的药物靶点的发现具有重要意义。

结论摘要：

本研究通过超高灵敏流式检测技术与细菌双杂交系统的有机结合，借助双色免疫荧光染色法，实现蛋白表达和蛋白－蛋白相互作用的单细菌水平定量表征和统计分析，发展了灵敏、快速、高分辨、高通量的蛋白－蛋白相互作用研究新方法。取得的重要进展如下 1）构建了新的带标签细菌双杂交体系。采用常规的蓝白斑筛选及比色定量法，验证了细菌双杂交体系的成功构建，确定了在相互作用蛋白上融合表达标签蛋白不会影响蛋白的相互作用。 2）建立了单个细菌水平低拷贝β-gal表达的超高灵敏流式检测方法。利用超高灵敏流式结合荧光底物C12FDG实现了单细菌水平β-半乳糖苷酶本底表达的检测，并结合MUG法定量出单个细胞中大约21个拷贝的β-半乳糖苷酶本底表达量(Biosens Bioelectron. 2013, 48, 49-55)。 3）在单细菌水平低拷贝β-gal表达的超高灵敏流式检测方法建立的基础上，进一步优化了针对细菌双杂交体系的C12FDG染色条件，成功实现了单细菌水平细菌双杂交体系蛋白相互作用的超高灵敏流式检测。 4）建立了单个细菌水平相互作用蛋白表达量分析的超高灵敏流式检测方法。利用免疫荧光法对融合表达的标签蛋白进行标记，通过超高灵敏流式检测仪获得细菌相互作用蛋白表达量的分布情况。同时建立了基于免疫荧光染色的单细菌水平β-半乳糖苷酶检测方法。 5）建立系统、完善的蛋白－蛋白相互作用研究方法。利用免疫荧光染色结合超高灵敏流式检测，对细菌双杂交系统进行了相互作用报告基因与蛋白表达的双参数检测，以BTH101 pUT18-Flag-Pal/pKT25-His-TolB为模型，选择不同的诱导时间点，考察并确定了Pal和TolB的蛋白表达量和相互作用报告因子的表达量成正相关。 6）增加了利用双荧光同时测定相互作用蛋白表达与相互作用强度之间的定量关系的研究内容。将该方法应用于对一系列相互作用强度已知的蛋白对进行单细菌水平的蛋白表达定量分析，以期得到细菌双杂交系统中蛋白相互作用强度与报告基因表达量之间的内在联系，建立一种快速检测蛋白相互作用强度的新方法。 7）此外，结合噬菌体对宿主菌的特异识别和双砷染料－四半胱氨酸体系，利用噬菌体只能在活菌中繁殖，通过对重组噬菌体四半胱氨酸的检测实现死菌和活菌的区分，创建了痕量细菌的灵敏、特异及存活状态的快速检测方法(Anal. Chem. 2014, 86, 907？912)