中文摘要：

遗传性抗凝血酶（AT）缺陷症是由编码AT蛋白的基因突变所引起的，是静脉血栓栓塞症的主要遗传性危险因素。Leu99是导致AT缺陷症的突变热点，已在多个家系中有报道，但突变导致疾病的分子发病机制目前仍未知。本项目在前期突变AT蛋白体外表达试验的基础上，拟通过纯化AT Leu99Phe突变蛋白，进行一系列功能检测试验（包括与肝素结合试验、抑制凝血因子IIa、Xa等活性）和结构检测试验（圆二色性检测二级结构变化和热稳定性），阐明Leu99Phe突变AT蛋白功能与结构的变化。同时通过对Leu99Ala（丙氨酸置换）、Leu99Ile（同源氨基酸置换）和Leu99Ser（极性氨基酸置换）突变体的研究，进一步阐明Leu99在AT蛋白中的重要作用。通过此项研究，将进一步了解AT作用的分子机制及其功能的结构基础，并对以结构为基础的抗血栓药物的研发具有重要意义。

结论摘要：

遗传性抗凝血酶（Antithrombin, AT）缺陷症是由编码AT蛋白的基因突变所引起的，是静脉血栓栓塞症的主要遗传性危险因素。Leu99（以下简称L99）是导致AT缺陷症的突变热点，已在多个家系中有报道，本项目对AT L99氨基酸位点突变导致遗传性AT缺陷症的分子机制进行了研究。通过果蝇细胞表达系统及AKTA蛋白分离纯化系统，我们表达纯化了野生型AT以及L99V、L99A、L99I和L99S等突变型AT蛋白，考马斯亮蓝染色及免疫印迹法显示各突变AT蛋白与野生型AT蛋白大小一致，未见明显杂带。通过肝素结合实验，我们检测了重组AT蛋白与低分子量肝素钠的结合能力，结果显示AT L99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与低分子量肝素钠的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的（44.8±3.6）%、（118.9±14.0）%、（15.2±8.8）%和（23.0±8.2）%。通过表面等离子共振技术（Surface plasmon resonance，SPR），我们检测了重组AT蛋白与凝血酶（FIIa）及活化凝血因子X（FXa）的结合能力，结果显示AT L99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与FIIa的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的13%、57%、3%和29%；AT L99V、L99A、L99I和L99S突变蛋白与FXa的结合分别为相同浓度野生型AT蛋白的7%、51%、1%和25%。将野生型及各突变型AT蛋白的浓度调整至正常AT血浆浓度后，通过发色底物法，我们检测了重组AT蛋白的活性，结果显示野生型AT蛋白及L99V、L99A、L99I、L99S等突变型AT蛋白活性分别为146.5%、21.4%、120.9%、10.8%和39.0%。圆二色性检测显示，AT L99突变后，二级结构发生变化，其中α-螺旋结构较野生型AT有所减少，而β-折叠结构较野生型AT有所增加。本项目已完成既定研究内容，证实L99位点突变改变了AT的二级结构，破坏了AT与肝素、FIIa及FXa的结合，L99突变使AT蛋白活性下降，从而导致遗传性AT缺陷症。