中文摘要：

嵌合抗原受体（CAR）修饰T细胞为肿瘤免疫治疗带来新的希望，它赋予T细胞靶向杀伤活性，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，改善宿主免疫耐受状态。然而，这种"超自然"T细胞的调控是临床基因和细胞治疗需要解决的关键问题。本课题设计可诱导的自杀基因iCaspase9，与肿瘤特异性抗原EGFRvIII的CAR相结合，建立CAR修饰T细胞的调控模型；体外试验探讨iCaspase9诱导CAR T细胞凋亡、理想治疗潜质的T细胞亚群、最佳的T细胞活化信号；动物实验通过CAR T细胞条件性消融模型、移植物抗宿主病模型、肿瘤原位移植模型探索CAR修饰T细胞肿瘤免疫治疗的调控性、安全性、有效性，可能的分子机制和应对策略。EGFRvIII是脑胶质瘤等多种恶性肿瘤表达率很高的肿瘤特异性抗原，肿瘤靶向治疗理想的分子靶点，本研究为肿瘤免疫治疗新策略提供实验依据、临床基因治疗提供调控手段、脑胶质瘤等恶性肿瘤探索新的治疗方法。

结论摘要：

嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR）是基于肿瘤“免疫编辑”理论的一种免疫治疗新策略，它将抗体对肿瘤抗原的亲和性和T细胞的杀伤活性相结合，赋予T细胞肿瘤细胞特异性杀伤，同时，克服肿瘤局部免疫抑制微环境，改善宿主免疫耐受状态。然而，这种“超自然”T 细胞的调控是临床基因和细胞治疗需要解决的关键问题。利用自杀基因调控基因修饰的细胞是基因治疗的安全措施之一。Caspase9是细胞凋亡信号通路上天然存在的人类蛋白，无免疫原性，通过化学诱导二聚化（CID）模式将其激活、启动细胞凋亡，可调控基因修饰的细胞。FKBP12（FK结合蛋白-12）作为CID在一些基因治疗中得到有益的尝试。本研究设计FKBP12诱导的自杀基因Caspase9作为安全开关，建立可调控的T细胞模型（iCasp9），体外试验获得T细胞条件消融相关数据，为基因修饰 T细胞免疫治疗提供安全保障。首先，构建iCaspase9表达载体FKBP12 (321bp，删除了效应区）和Caspase9 (846bp，删除了内源激活区和蛋白招募区）以linker 连接后克隆入pCDH-CMV-MCS-EF1-puro（命名为piCasp9）；然后，制备iCasp9慢病毒，转导Jurkat T细胞，puromycin筛选稳定表达的抗性细胞；Western blot鉴定iCasp9稳转细胞。体外试验证实CID（AP20187）能够诱导iCasp9-Jurkat T细胞凋亡。MTT法试验显示不同浓度AP20187（0,5,10,50,100nM）下，细胞存活率逐步下降，证明了剂量依赖性细胞凋亡；Annex V染色-流式细胞法检测显示10nM AP20187处理iCasp9-Jurkat T细胞后，细胞发生时间依赖性凋亡。本研究利用iCasp9 建立可调控细胞模型为基因/细胞治疗提供了实验依据。