中文摘要：

对萜类化合物进行深入研究不仅在理论方面能够使我们更加深入了解生物进化过程中次生代谢物在种群、群落形成过程中的作用，而且在应用方面对开发新的药物具有重要意义。萜类化合物研究中最令人感兴趣的问题是生物是如何产生出数量如此众多的萜类化合物的。萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决萜类化合物多样性的首要问题。本项目选择菊科植物中催化产物骨架不同、同源性最高（相似度69%）的青蒿caryophyllene合酶和加拿大一枝黄花germacrene合酶作为研究对象，结合生物信息学和分子生物学研究方法，对这两个酶进行选择性片段替换和定点突变，研究突变后催化特性的改变，以期获得决定这两种酶催化特异性位点信息，为进一步阐明进化关系接近的另四种酶的催化特异性决定位点以及倍半萜合酶功能进化过程中的变化特点打下基础，并为最终实现通过合理设计来改变萜类合酶催化特异性而产生新结构化合物提供新的实验依据。

结论摘要：

萜类化合物研究中最令人感兴趣的问题是生物是如何产生出数量如此众多的萜类化合物。萜类环化酶催化机理特别是催化特异性的揭示是解决萜类化合物多样性的首要问题。本项目对菊科植物黄花蒿Amorpha-4,11-diene合酶（ADS） 进行片段替换、删除和定点突变，研究突变后催化特性的改变，最终发现了影响此酶催化特异性的氨基酸位点，并且也明确了活性中心不同位置的氨基酸对酶催化特性的影响，还初步探讨了 C、N两末端的作用。 对ADS活性中心周围9个氨基酸共18种突变体的功能分析发现，活性中心周围氨基酸的突变对其催化活性和特异性的影响因氨基酸位置不同而有明显差异。其中，（1）位于G1和G2螺旋之间的纽结处的突变（G401A）显著改变了催化产物的比例，显示此处影响酶的催化特异性；（2）位于活性中心区接近底物的的4个芳香族氨基酸W271、Y519、F370、和F514的突变显示， W271和Y519的突变（W271F,Y519L)造成活性完全丧失，而F370、和F514突变（F370L、F514L）后则保持活性，也未引起产物改变。这表明W271和Y519是通过cation-π作用稳定碳正离子中间体的主要氨基酸，F370 和F514所处的位置空腔变大并不影响产物特异性；（3）通过G439的三个突变（G439A、C、V）功能分析发现，G439所处的位置的空腔较小变化（G439A）不影响其活性，但是更大变化则使其活性大大降低（G439C）甚至丧失（G439V）。 另外，通过缺失和点突变初步探讨了黄花蒿ADS C、N两末端的作用。发现（1）N端对酶的活性的保持具有重要作用，N端缺失20个氨基酸可使酶活性完全丧失，而对N端的两个非常保守的氨基酸R10和W20突变（R10G,W20R）则对活性并无影响，显示N端可能是作为一个整体起作用，单个氨基酸的变化不会影响其活性。（2）C末端的6个氨基酸的缺失对酶活性无影响，而缺失14个氨基酸则使活性完全丧失。 以上这些发现为进一步阐明进化关系接近的另四种酶的催化特异性决定位点以及倍半萜合酶功能进化中的变化特点打下基础，并为最终实现通过合理设计来改变萜类合酶催化特异性而产生新结构化合物提供新的实验依据。