中文摘要：

非病毒基因载体因其良好的生物安全性已成为基因治疗的研究热点，然而其低的转染效率却成为发展的障碍。本项目针对非病毒基因载体体内转染效率低的问题，设计合成了一种新型的非病毒阳离子聚合物基因载体。在生物相容性良好的壳聚糖骨架上通过环境敏感的二硫键和/或二硒键接枝基因转染效率高的聚精氨酸和经靶向修饰的聚乙二醇（PEG）链段，构建同时具有长循环、智能、靶向等多种功能的阳离子聚合物基因载体。通过载体/基因复合物对细胞的转染，研究这类新型非病毒基因载体的组成和结构等因素对细胞转染效率的影响；通过对载体/基因复合物在体内循环、跨膜途径、溶酶体逃逸、细胞质运输以及入核机制等过程的研究，深入揭示多功能阳离子聚合物基因传输系统高效转染细胞的影响因素、作用规律以及作用机理，为高效非病毒基因传输系统的设计构建提供新的思路和方法，促进基因治疗研究的发展。

结论摘要：

本项目针对目前非病毒基因传输系统研究中面临的基因载体转染效率低和细胞转染机理不明确这两大问题，以载体材料仿生的指导理念，设计构建了一种基于改性壳聚糖的新型的多功能非病毒基因传输系统（AAA-CS）并研究其细胞内基因转染机理，同时将此改性壳聚糖材料用于组织创伤修复和抗肿瘤药物传输。利用核磁对改性壳聚糖结构特征和性质进行研究和表征，计算得接枝率在30%左右。利用电位滴定法对壳聚糖及其各衍生物的缓冲能力进行研究，结果表明碱性氨基酸修饰后的壳聚糖的缓冲能力较壳聚糖有明显提高。按不同N/P比将AAA-CSs与质粒进行复合装配，形成AAA-CSs/pDNA复合纳米粒子。采用TEM、AFM、Zeta电位测定等方法对纳米粒子的形貌及电位进行系列研究和比较，结果显示AAA-CSs与DNA通过电荷自组装后可形成球状且粒径均一的纳米颗粒，平均粒径在100nm左右；复合后受所结合DNA携带负电荷影响，纳米粒子电位出现不同程度下降。采用凝胶阻滞实验方法对AAA-CSs与质粒的复合能力进行了研究，结果显示当电荷比大于或等于8:1 时，碱性氨基酸修饰后的壳聚糖可完全包覆住DNA。利用MTT法对材料的细胞毒性进行研究，结果表明不同浓度的AAA-CSs材料及AAA-CSs/pDNA复合纳米粒子的细胞存活率均在95%以上，具有良好的生物安全性。TOTO-3标记质粒后利用激光共聚焦显微镜在不同时段对细胞吞噬能力进行研究，发现细胞对纳米粒子有较强吞噬能力，其吞噬效果具有时间依赖性。利用pEGFP-C1和 pGL3-control报告基因考察了AAA-CSs作为基因载体材料在体外对HEK293细胞的转染效果。通过小鼠胫骨前肌注射方法对其在动物体内肌肉部位的表达效率进行研究，结果显示氨基酸修饰后的壳聚糖基因载体具有较高效的体内外基因传递和表达效率。在改性壳聚糖用于组织创伤修复的研究中，制备了深Ⅱ度烫伤动物模型，深入研究了AAA-CS在皮肤创面的原位转染修复作用，创面愈合率、组织学、血流灌注量等实验结果都表明该阳离子载体具有非常显著的原位转染修复功能。