中文摘要：

金黄色葡萄球菌是引起人和动物感染的一种最主要的病原菌，其耐药性的增强大大增加了治疗难度，而生物被膜的产生是其致病性和耐药性形成的重要原因之一。因此，找到有效的抗金黄色葡萄球菌生物被膜药物已成为刻不容缓的任务。我们研究发现，中药甘草的主要成份甘草查耳酮A对金黄色葡萄球菌生物被膜有显著抑制作用，但其作用机制尚不清楚。本课题拟在生物被膜体外模型基础上，借助我们建立的药物抗菌作用机制全基因组芯片高通量分析平台，考察模式菌ATCC 29213生物被膜在甘草查耳酮A压力下的基因表达变化及其作用的代谢通路，通过明胶酶谱分析、靶基因Knock-out、荧光定量PCR、Western-blot等进行确证，用绿色荧光蛋白标记结合激光扫描共聚焦显微镜和流式细胞术观察药物对生物被膜微观结构的影响，阐明甘草查耳酮A抗金黄色葡萄球菌生物被膜的分子机制，为甘草查耳酮A作为先导化合物进一步开发应用及新药靶标筛选奠定基础。

结论摘要：

金黄色葡萄球菌（简称金葡菌）是引起人和动物感染的一种最主要的病原菌，其耐药性的增强大大增加了治疗难度，而生物被膜的产生是其致病性和耐药性形成的重要原因之一。因此，找到有效的抗金葡菌生物被膜药物已成为刻不容缓的任务。我们前期研究发现，甘草查耳酮A对金葡菌生物被膜有显著抑制作用，但其作用机制尚不清楚。在本研究中，我们成功构建了体外生物被膜模型和体外生物被膜药敏分析方法，通过刚果红等实验鉴定了21株金葡菌的生物被膜形成能力；通过肉汤二倍稀释法考察了甘草查耳酮A对金葡菌的悬浮菌最低抑菌浓度（MICs）和最低杀菌浓度（MBCs），用琼脂平板法测定了甘草查耳酮A的最低抑生物被膜浓度（MIBCs）和最低杀生物被膜浓度（MBBCs），通过激光共聚焦从微观结构考察了甘草查耳酮A对24 h、48 h生物被膜的清除能力，结果显示甘草查耳酮A对金葡菌悬浮菌和生物被膜有较好抑制活性。通过分光光度计法和XTT法测定甘草查耳酮A对金葡菌的生长抑制曲线，选择1 h 4 × MIBC用于金葡菌生物被膜芯片转录组学研究，基因表达谱分析表明与悬浮菌相比，甘草查耳酮A作用导致被膜态菌817个基因的表达水平发生显著变化（≥2 倍），其中355个基因上调，462个基因下调，其中甘草查耳酮A显著抑制自溶素及相关转录调节基因、生物被膜形成基因的表达；另外，显著影响细胞壁相关蛋白编码基因、菌蛋白合成基因、荚膜多糖编码基因、毒力因子等的表达；实时荧光定量PCR验证了部分芯片结果，明胶酶谱分析在蛋白水平确证了甘草查耳酮A对菌株自溶素的抑制；构建了S. aureus ATCC 29213的ica（icaADBC及icaR）缺失菌株，进一步证明抑制ica表达确实可以降低金葡菌生物被膜的形成。总之，甘草查耳酮A通过抑制生物被膜形成基因ica及自溶素相关基因的表达两个方面同时抑制金葡菌生物被膜的形成。另外，还利用项目研究过程中建立的多个平台和模型进行了适当的拓展研究，筛选到异欧前胡素等12种先导化合物或临床药物单独（或组合）在体外、免疫细胞内或者动物模型体内有显著抗细菌生物被膜和抗细菌毒力能力，并通过生物芯片技术及Western-blot、绿色荧光蛋白标记和流式细胞术等技术阐明了相应的作用机制。本研究在国际上首次阐明甘草查耳酮A的抗生物被膜分子机制，而拓展研究的新发现对抗生物被膜相关的新型抗菌药物开发具有重要意义。