中文摘要：

基于国内外目前对猪链球菌耐药机制的研究现状，借鉴其它细菌的研究成果，本项目拟以具有双重主动外排基因mef/msr的猪链球菌为研究对象，通过染色体DNA步移测序技术确定mef/msr插入位置及周围基因序列，采用同源重组技术构建mef、msr突变株及mef/msr双重突变株及互补菌株，采用real time RT-PCR和放射性标记药物胞内蓄积浓度测定等手段佐证外排泵的存在及功能，解决如下问题1.明确mef/msr基因在猪链球菌中的定位及其周围基因环境；2.mef和msr分别在猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药机制中的作用；3.明确耐药基因的传播与转座子及与四环素耐药基因tetO的关系。通过解决这些问题，深入了解介导猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药的主动外排机制及耐药性传播特性，对于指导临床合理使用抗生素和防止耐药株的流行有着重要意义，并为开发猪链球菌耐药性检测试剂盒、发掘新的药物靶位提供新思路。

结论摘要：

猪链球菌2型是新发的人兽共患病病原，临床耐药性调查结果显示猪链球菌对常用大环内酯类抗生素的耐药率呈逐年上升趋势。研究显示革兰氏阳性菌对大环内酯类抗生素耐药性的迅速传播和蔓延与Mef和 Msr外排蛋白相关，且这些外排泵位于可移动基因元件上并与其它耐药基因共表达，介导多药耐药性的水平传播。本项目以此为切入点，采用相应的实验技术和研究手段，探讨mefA/msrD介导猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药的机制及与其它抗生素耐药基因之间的相关性，明确mefA和msrD在猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药中的贡献；分析携带与mefA/msrD相关的可移动基因元件，推测其在mefA和msrD耐药基因水平传播中的作用。结果表明1.国内临床分离猪链球菌对大环内酯类抗生素产生耐药性，大环内酯类抗生素耐药猪链球菌的耐药机制由ermB和 mefA/msrD介导；mefA/msrD基因与四环素耐药基因tetO及转座子基因相关性极高；人工诱导耐药菌株与临床耐药菌株的耐药机制存在差异，主要由23S rRNA，L4和L22核糖体蛋白突变引起；2.基因缺失和细菌体内红霉素蓄积实验证实mefA在猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药中作用较msrD重要。 3.获得猪链球菌mefA/msrD基因上下游23 kb的相关片段，Vector NTI软件分析该片段含有24个ORF，其中5和6 ORF分别为mefA和msrD基因，其它ORFs均为噬菌体相关基因，该基因元件的插入位点在猪链球菌基因组的rum基因上，且该基因元件与噬菌体结构相关，并通过丝裂霉素C诱导出相关的噬菌体。4. PFGE和MLST技术对临床分离的猪链球菌进行分子分型，发现4株mefA和msrD耐药菌分为3个PFGE谱型；根据等位基因序列号与UPGMA系统进化树图谱，4株菌分属3个ST型，显示耐药菌株分属不同的克隆株，提示mefA和msrD存在着水平传播的现象。通过该项目研究，深入了解了猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药的主动外排泵机制及耐药性的水平传播特性，对于指导临床合理使用抗生素和防止耐药株的流行有着重要意义，并为发掘新的药物靶位提供新的探索途径。除此以外，该项目在研究过程中，采用蛋白组学方法在mefA和msrD阳性菌株中筛选到与氟喹诺酮类耐药相关的外排蛋白；发现猪链球菌能够形成生物被膜，并且大环内酯类抗生素阿奇霉素对猪链球菌生物被膜的生成有一定抑制作用。