中文摘要：

本课题组前期首次获得了I型钠离子通道（SCN1A）基因的转录起始点及包含启动子的顺式作用元件，同时发现癫痫伴热性惊厥附加症患者数个顺式元件突变，其中转录起始点上游662G缺失突变导致SCN1A启动子活性下调。拟利用DHPLC、MLPA及直接测序技术筛查编码区阴性突变患者的可能作用元件，结合临床表型初步分析顺式元件致病性。构建突变及各种截短顺式元件的荧光报告基因载体，转染SH-SY5Y细胞系，体外实验研究作用元件及核心启动子的功能及致病性。重新程序化携带顺式作用元件突变的患者成纤维细胞，在神经细胞水平上研究其致病机制；最后通过基因打靶技术，建立转基因动物模型，利用全细胞膜片钳技术记录脑片电生理的变化，统计比较，研究突变顺式元件的致病性。本研究紧密结合临床，在分子、细胞及整体上研究SCN1A基因启动子及其它功能性顺式作用元件的调控机制及致痫机制，为难治性癫痫提供新的、有效的诊治方案，造福患者。

结论摘要：

Dravet综合征（Dravet Syndrome，DS），是最为严重的癫痫伴热性惊厥附加症，电压门控性钠离子通道α1亚型基因（voltage-gated sodium channel α1 subunit gene ，SCN1A）表达量的改变是其主要原因。除了编码区，基因表达还受到顺式作用元件的调控。本课题组前期确定SCN1A基因的转录起始点，其上游1 kb以内分布有大量的与启动子元件序列一致的位点。我们选取SCN1A5′UTR高度保守的区域及人类3个常用的5′端非翻译外显子(h1a/h1u, h1b, h1c/h2u)上游1 kb、下游0.2 kb的范围，对SCN1A编码区点突变阴性的21例DS患者及110个正常对照进行点突变、SNPs及CNVs筛查、统计学分析及生物信息学预测转录因子；构建目的质粒转染HEK-293, SH-SY5Y和NT-2细胞测定双荧光素酶活性；诱导患者体细胞通过iPSCs分化为神经元开展电生理功能的研究。21例患者未发现点突变及CNVs，c.1-76155G>-及等位基因rs16851669和rs16851666的频率明显高于正常人群（P值分别为0.026、0.025、0.034）。PROMO预测显示三个SNPs均增加了转录因子结合位点。以上3个及rs80169419C>T为1个连锁不平衡区域，构建4个单体型；21个DS与正常均以单体型1为主，但单体型2在DS中占31%左右，约为正常人的2倍，具差异显著（P = 0.026）。双荧光素酶活性结果显示在HEK293细胞中，单体2型质粒较单体1型质粒活性有明显降低(P <0.01)，而在SH-SY5Y及NT-2细胞，两者均无明显转录活性。建立了1例DS及1例轻型患者的iPSCs，诱导分化为神经元，电生理功能显示谷氨酸能神经元过度兴奋，具有放大及持续性钠电流激活、动作电位发放更密集及典型的癫痫样自发性动作电位。与轻型相比，DS来源的神经元过度兴奋性更高但能被苯妥英钠减轻。总之SCN1A 5′UTR点突变及CNVs在DS患者中发生率低h1u-668至-52区存在负性作用元件；单倍型2型可能降低DS患者h1u上游启动子活性，但与DS的关系有待证实；建立了高效iPSCs产生及诱导分化为神经元技术，为个性化药物的筛选及在神经元模型上开展调控元件功能研究奠定了良好的基础。目前发表标明资助的SCI论文6篇。