中文摘要：

前期研究表明，可用于生物人工肝系统的肝癌细胞株HepG2的氨代谢功能不足，原因在于氨代谢两条通路上的关键酶- - - - 人谷氨酰胺合成酶（hGS）、人精氨酸酶I（hArgI）和人鸟氨酸转氨酶（hOTC）表达低下或缺失。本研究通过克隆hGS、hArgI和hOTC的cDNA并通过双基因表达载体分别将hGS与hArgI或hOTC基因导入HepG2细胞、hArgI和hOTC基因导入HepG2-hGS或HepG2-AFhGS细胞（前期构建），筛选培养抗性细胞株。利用基因芯片技术分析转hGS、hArgI和hOTC基因对HepG2细胞基因表达谱的影响，定量PCR、Westernblot和生化酶学分析氨代谢酶的表达以及对氨代谢能力的影响，分析细胞增殖、周期和凋亡的改变；从中选择降氨功能最强最稳定的细胞株，微载体聚集培养后组装于混合型生物人工肝系统并进行肝衰模型的治疗，评价其应用价值。

结论摘要：

目的本研究通过双基因真核表达载体将通路2（尿素代谢通路）的人精氨酸酶1（hArgI）基因和人鸟氨酸转氨酶（hOTC）基因导入氨代谢功能低下的人肝癌细胞株HepG2，从而获得具有强降氨能力的细胞株；并将通路1（谷氨酰胺代谢通路）的人谷氨酰胺合成酶（hGS）基因导入通路2恢复的HepG2细胞，通过氨代谢双通路关键酶的过表达，比较氨代谢双通路的恢复对HepG2细胞生物学功能的影响。另外，通过构建微型生物人工肝系统（BAL），评估所获得细胞株的实验应用价值。结果（1）HepG2/hArgI1、HepG2/hOTC2和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞成功建立并证实过表达hArgI或/和hOTC；HepG2/hArgI1和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的hArgI酶活力以及HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的hOTC酶活力均高于对照细胞（P<0.05）；hArgI或/和hOTC的过表达促进了氨代谢其它相关蛋白的表达。HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞的耐氨能力显著提高，是HepG2的3倍，达到人原代肝细胞的3/8；降氨能力上，在NH4Cl浓度达180mM浓度时，尿素生成量是HepG2的3.1倍，达到人原代肝细胞的63.1%；在NH4Cl浓度为120mM和Glu浓度为15mM时，Gln生成量是HepG2的3.1倍，达到人原代肝细胞的36.0%。（2）HepG2/AFhGS和HepG2/hArgI+hOTC+AFhGS细胞的耐氨能力、在高浓度氨环境下的尿素和谷氨酰胺生成量均显著高于对照细胞（P<0.05）。（3）尽管生存分析显示实验组间的差别没有统计学意义，但HepG2/(ArgI+OTC)4细胞治疗组的肝衰模型耐氨和降氨能力还是较HepG2细胞治疗组有很大提高（P<0.05），其他各项生化指标也都优于HepG2细胞治疗组（P<0.05）。结论（1）体内外实验证明HepG2/(hArgI+hOTC)4具有强降氨能力。（2）高表达hGS的HepG2/hArgI+hOTC+AFhGS细胞株在体外培养的降氨能力不如HepG2/AFhGS和HepG2/(hArgI+hOTC)4细胞，氨代谢双通路关键酶的过表达并不能进一步提高HepG2细胞的氨代谢能力。（3）自行构建的简易微型生物人工肝系统能为各种侯选细胞材料的治疗应用提供良好的研究平台。