中文摘要：

代谢工程改造获得高产菌株时，通常的做法是直接过量表达目标途径上某一（或某些）代谢酶。这往往导致这一（些）代谢酶的表达水平比自然界中存在于任何途径中的都高。过高的表达量，不但会造成细胞内原料物质的浪费，还可能诱发胁迫响应，最终限制了目标产物产量的提高。因此，如何通过提高代谢酶的催化效率，以实现在较低表达水平下，仍保证其代谢途径以令人满意的速率进行，是一个值得探究的关键性问题。本研究依据微生物代谢中体现出的"经济性原则"的事实，尝试利用代谢酶空间组织工程原理，借助蛋白之间特定相互作用而形成的支架结构，将苯丙氨酸（L-Phe）生物合成途径中的两个关键酶（DS和CM-PDT酶）与其临近的代谢酶进行设计，使其按照优化的比例以活性多酶复合体的形式表达出来，从而模拟天然存在的底物沟道传递与加工机制，期望在维持酶表达水平较低的情况下实现对酶催化效率的改善。这将为相关代谢工程研究提供崭新的思路。

结论摘要：

代谢工程已经成为生物产品制造的一个重要手段。代谢效率的提高是实现理想产率和产物滴度的关键。本研究利用代谢酶空间组织工程策略，实现其效率的提高。按照原定的研究方案和计划，并结合最新文献报告，分析和探讨了细菌中利用代谢酶空间组织工程进行代谢工程研究时可用的调控策略，以及构建代谢途径时的方法，并开发了非常适合代谢酶空间组织工程研究的表达策略强制翻译终止法。通过克隆来源于大肠杆菌中莽草酸代谢途径以及分支酸代谢途径中与苯丙氨酸（L-Phe）合成代谢相关的关键酶基因，通过表达载体构建单独表达基因的多个重组菌，通过发酵验证确定L-Phe合成代谢途径中的限速酶是DS和CM-PDT酶，进一步通过构建串联表达关键酶基因的不同组合，通过发酵实验验证，获取了最佳的两个关键酶基因的组合，对其进行发酵条件以及发酵培养基优化，进一步提高了L-Phe的产量至4.64g/L。综合上面的研究结果，进一步结合中心代谢途径两个酶基因的表达进一步提高L-phe的前体物质PEP,E4P的供应提高L-Phe。分别尝试了用单质粒和双质粒表达四个相关基因的方法，L-Phe的产量得到了进一步提高。通过基于反转录的代谢分析表明，多基因串联表达时候，单一启动子的使用难以保证串联基因的有效表达，因此多启动子的采用应该是基于代谢酶空间组织工程的代谢工程研究的关键。