中文摘要：

牙髓干细胞的发现为组织工程再生牙提供了可行性。然而天然牙髓组织中干细胞数量很少，分离扩增过程繁琐费时；而且大部分细胞增殖分化能力有限，多为异质性细胞。以上特点使牙髓干细胞作为种子细胞应用的可能性受到限制，成为阻碍目前牙组织工程进一步发展的主要问题。诱导干细胞技术是近年来生物医学研究领域取得的突破性成果, 通过外源基因诱导能够将已分化细胞重新去分化成为多能干细胞。最新研究表明，相关外源基因的表达只是在诱导的早期是必需的，提示不需要经过基因整合，仅仅通过基因瞬时表达就能够诱导干细胞的产生。本研究旨在通过腺病毒介导建立Oct4、Sox2基因瞬时共表达系统，感染人牙髓细胞，观察基因表达过程中牙髓细胞增殖分化潜能的改变。尝试应用基因瞬时表达直接诱导人牙髓细胞去分化，使之转化为多能干细胞，进而探讨此牙髓来源的诱导多能干细胞在牙组织工程中的应用潜力，以期为牙组织工程及临床应用提供新的思路。

结论摘要：

诱导多能干细胞技术是近年来生物医学研究领域取得的突破性成果, 通过外源基因诱导能够将已分化细胞重新去分化成为多能干细胞。最新研究表明，相关外源基因的表达只是在诱导的早期是必需的，提示不需要经过基因整合，仅仅通过基因瞬时表达就能够诱导干细胞的产生。本研究旨在通过腺病毒介导建立Oct4基因瞬时表达系统，感染人牙髓细胞，观察基因表达过程中牙髓细胞增殖分化潜能的改变。尝试应用基因瞬时表达直接诱导人牙髓细胞去分化，使之转化为多能干细胞，进而探讨此牙髓来源的诱导多能干细胞在牙组织工程中的应用潜力，以期为牙组织工程及临床应用提供新的思路。项目组通过腺病毒Ad Max系统构建了携带人Oct4(BC020712) 基因ORF片段的瞬时表达载体 Ad-Oct4。原代培养的人牙髓细胞呈现出成纤维细胞样外观。通过表型检测证实为中胚层来源。免疫荧光显示重组载体能够成功及高效的转染人牙髓细胞，表达外源性Oct-4蛋白，而未转染的牙髓细胞不表达Oct-4蛋白。同时，Oct-4感染细胞呈现出的增殖潜能显著升高，细胞周期检测发现通过Oct-4感染，能够显著诱导人牙髓细胞从G0/G1期进入S期。在此基础上，项目组进一步通过流式细胞学检测，发现Oct-4感染细胞的间充质干细胞特异性表面标记物STRO-1、CD146、CD29、CD44较之未转染细胞有显著表达增高。项目组继续利用腺病毒Ad-Oct4感染、诱导第四代人牙髓细胞转化产生具有胚胎干细胞表型的细胞克隆，将其分别培养于矿化、成脂、成神经、成肌及成软骨诱导环境，通过Real-time PCR、免疫组化及组织化学染色检测成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、肌细胞及软骨细胞相关特异性标记物的表达，评估阳性转化细胞多向分化的能力。结果表明腺病毒Ad-Oct4诱导的阳性转化细胞具有成骨、成脂、成神经、成肌及成软骨细胞分化的能力。裸鼠皮下移植实验表明，Oct-4感染细胞能在动物体内增殖，并形成畸胎瘤，DSP免疫荧光证实成牙本质样基质的分泌。总之，研究结果提示通过Ad-Oct4瞬时感染人牙髓细胞，有可能诱导细胞去分化，恢复间充质干细胞的表型，获得干细胞的生物学特性。