中文摘要：

脑缺血诱导MLK3活化，继而激活下游凋亡通路导致神经元死亡。MLK3是脑缺血抑制细胞凋亡调控的关键靶点，但其活化的分子机制仍未阐明。预实验结果表明，脑缺血诱导MLK3发生SUMO化修饰（即蛋白质翻译后修饰），并且变化趋势与MLK3激活时程一致，提示SUMO化修饰可能参与调控脑缺血MLK3活性及下游凋亡信号通路。本研究采用生物化学、分子生物学等方法研究脑缺血MLK3的SUMO化修饰对MLK3激酶活性及其下游信号转导的调控，主要研究内容如下（1）脑缺血诱导MLK3 发生SUMO化修饰的变化规律和调节机制；（2）MLK3与SUMO化相关酶的相互作用及SUMO化修饰对MLK3活性的调节；（3）抑制MLK3的SUMO化修饰对脑缺血MLK3-JNK3凋亡信号通路以及下游的核和线粒体凋亡通路的调节。通过以上研究，阐明脑缺血诱导MLK3活化的分子机制与关键信号分子，筛选药物干预治疗的主要环节和潜在靶点。

结论摘要：

MLK3（mixed-lineage kinases 3）是丝/苏氨酸蛋白激酶，通过活化下游MKK4/7-JNK/p38等凋亡信号通路参与细胞凋亡调控。脑缺血可诱导MLK3活化，但是关于其活化的分子机制仍有待进一步阐明。SUMO化（SUMOylation）为蛋白质翻译后修饰方式之一，即将SUMO蛋白（small ubiquitin-like modifier）共价结合到底物蛋白的赖氨酸残基上。SUMO蛋白有三个成员SUMO1、SUMO2和SUMO3。文献报道，脑缺血可诱导大量蛋白与SUMO1和SUMO2/3结合发生SUMO化，但发生SUMO化的底物蛋白以及其在神经元损伤中的作用仍有待阐明。本研究发现，脑缺血促进MLK3与SUMO1结合发生SUMO化，其SUMO化水平随着缺血再灌注时间的延长而逐渐升高，与MLK3激活时程相一致，提示MLK3 SUMO化在缺血性脑损伤中发挥病理作用。脑缺血再灌注后MLK3与SUMO连接酶PIAS3的结合逐渐升高，PSD-95可促进MLK3与PIAS3结合及MLK3 SUMO化，因此MLK3-PIAS3-PSD-95信号模块的组装可作为治疗脑中风潜在的药物干预靶点。PIAS3的氨基端肽段为与MLK3相互作用的主要区域，此肽段有望成为干预MLK3-PIAS3结合及MLK3发生SUMO化的有效措施。MLK3发生SUMO化的主要位点为赖氨酸401位，SUMO化可通过促进MLK3磷酸化而上调其激酶活性，此外SUMO化还可增强MLK3的蛋白稳定性，进一步揭示了SUMO化对MLK3自身功能的调控。文献报道，脑缺血后含GluK2亚基的海人藻酸受体参与MLK3-JNKs信号的调控。本研究发现，MLK3发生SUMO化后，可激活海人藻酸诱导的MKK7-JNKs凋亡信号通路，促进凋亡蛋白c-Jun和Caspase-3的活化，最终导致神经元的死亡。此外，脑缺血可促进GluK2发生SUMO化，后含GluK2亚基的海人藻酸受体发生内吞，GluK2与MLK3结合，上调MLK3激酶活性，GluK2-MLK3信号模块的组装可成为治疗缺血性脑中风的一个有效干预靶点。本项目不仅按计划研究了MLK3 SUMO化在缺血性脑损伤中的作用，还额外研究了MLK3过度活化的上游调控机制，发现了3个药物干预MLK3过度活化的主要环节和靶点，可为缺血性脑中风的临床药物开发提供依据。