中文摘要：

2009年全球爆发的甲型H1N1流感疫情对快速研制新型病毒疫苗提出挑战。世卫组织提供的甲流病毒疫苗株在鸡胚内繁殖效率低和鸡胚供应紧张造成疫苗生产能力不足。鸡胚生产的灭活疫苗对鸡蛋过敏者不适用，残留病毒基因组具有潜在风险，发展新型安全病毒疫苗势在必行。病毒样颗粒（VLPs）由病毒结构蛋白自我组装而成并保持病毒粒子构象，是一种安全高效的候选疫苗。杆状病毒表达系统是获得由多个病毒结构蛋白构成的流感病毒样颗粒的唯一系统。为克服杆昆虫培养细胞内VLPs产量低、生产成本高和下游纯化复杂等不足，本项目以甲型H1N1流感病毒为研究对象，采用具有自主知识产权的多基因表达家蚕生物反应器经济高效地制备甲型H1N1流感病毒样颗粒。结合上游病毒构建和下游纯化技术，研究如何在家蚕幼虫中高效表达和组装流感病毒样颗粒,并探索从虫体纯化、检测和制备VLPs最佳方案，研究其免疫学性质，为制备甲流病毒样颗粒疫苗打下基础。

结论摘要：

本项目完善了已有的杆状病毒-家蚕幼虫多基因表达系统，建立了具有自主知识产权的新型高效多基因表达家蚕生物反应器。该平台克服了传统家蚕生物反应器的缺点，首次建立了同时表达10个外源基因的多基因表达体系。具有构建重组家蚕杆状病毒时间短、效率高，表达外源基因数目多，表达量显著提高，生产成本低等特点。经济高效地应用于活性蛋白、全价抗原、病毒样颗粒疫苗等产品的生产。为适应多基因表达系统，对16个不同来源的启动子的表达活性在细胞与虫体水平进行了系统研究，选择出合适于不同时间表达及适用于哺乳动物细胞表达的启动子。 用高效多基因表达家蚕生物反应器构建了三种同时表达甲型流感病毒H1N1的HA、NA 和M1 三个病毒结构蛋白的重组家蚕杆状病毒。 分别为携带单拷贝、双拷贝及四拷贝HA,NA和M1的重组病毒。家蚕幼虫中表达了三个目标基因且成功组装出Ｈ１Ｎ１病毒样颗粒。分析了携带1,2,4拷贝各种重组病毒感染家蚕幼虫后VLPs的表达和装配情况。单拷贝重组病毒VLPs产量为11μg/头，双拷贝为28μg/头，4拷贝达35μg/头。通过增加拷贝数可以增加VLPs产量，其中表达双拷贝HA、NA、M1产量增加2.5倍，4拷贝增加3.2倍。构建双拷贝重组病毒较合适，因拷贝数越多，构建越困难，且易导致启动子之间竞争。 由HA、NA、M1组成的H1N1 VLPs经注射免疫和黏膜免疫接种BALB/C小鼠均能够产生高水平的IgG和IgA。攻毒实验表明10 μg VLPs注射接种和20μg鼻腔粘膜免疫后，这两种免疫方式均能产生高效地免疫保护效果。所生产的H1N1 病毒样颗粒有望成为一种安全高效的H1N1黏膜接种候选疫苗。双拷贝重组病毒感染一头家蚕幼虫所生产的VLPs 足够注射免疫接种一次，体现了多基因表达家蚕生物反应器生产VLPs经济高效的特色。而口服免疫100μg VLPs，血清抗体和黏膜抗体水平均较低，免疫保护效果较差，需要进一步在提高其抗肠胃道消化能力等方面进行研究。 项目已发表论文3篇，含SCI 论文2篇，核心期刊1篇，发明专利2项，南阳市科技进步一等奖1项。培养教授1名，省厅级学术带头人2名，副教授2名，更多研究成果将在2-3年内陆续发表。