中文摘要：

目前结核与艾滋病共感染，多药耐药及广泛耐药的发生率不断上升，对于结核病的控制亟需新的药物出现。现在临床使用的大多数抗结核药物都是针对增殖期结核分枝杆菌。而非生长状态的体内持留性结核分枝杆菌的存在是结核病病程迁延和复发的主要原因，并因此导致了耐药菌的不断出现。因此针对耐药菌和持留菌的特点开发新型药物，是抗结核药物研发的热点之一。乙醛酸循环是结核杆菌被巨噬细胞吞噬后进入持留期赖以生存的代谢途径。苹果酸合酶(Malate Synthase，MS)是该途径中的关键酶之一，并被证明对结核杆菌的持留性和毒力具有重要作用。对MS蛋白结构的分析表明它是一个"druggable"药物靶点。因此本项目拟以MS为蛋白靶标，建立灵敏性高、质量稳定的高通量药物筛选模型，并针对海洋微生物天然产物库筛选MS抑制剂，期望获得抗结核持留菌的有潜在应用价值的新型先导化合物。

结论摘要：

多药耐药结核的出现使得结核病的治疗面临更大的挑战。 结核杆菌能够转入持留状态使其对传统的治疗药物产生耐药性，并且能够在营养贫瘠的环境下生存。研究发现结核杆菌维持持留状态主要利用乙醛酸循环，该循环中两个关键酶苹果酸合酶（MS）及异柠檬酸裂解酶，使其能够绕开TCA循环而利用二碳化合物如脂肪酸等作为初级碳源维持生存。因为乙醛酸循环在哺乳动物中不存在，因此成为非常有吸引力的药物靶标。苹果酸合酶（MS）成为我们研究抗菌药物的靶标，并建立可靠的酶-底物复合物的筛选模型。本课题与国外单位合作，克隆了结核分枝杆菌MS的表达基因glcB，并在Escherichia coli 中进行了表达，对表达蛋白GlcB进行了纯化并对酶的活性进行了分析。之后建立了筛选模型来筛选潜在的MS抑制剂。 我们首先利用BCG模型对本实验室的天然产物库进行了筛选，对活性菌株进行了分离，得到一批抗结核活性化合物，然后对纯化合物进行了MS酶抑制活性测试，发现Echinomycin表现出非常强的抑制活性(IC50 1.7 μM)。随后，利用表面等离子共振（SPR）检测技术，对该化合物与酶的结合进行了验证，在6.4 nM 浓度时KD值为6.44×10-9， 证明了二者之间的强作用力。同时也发现了Echinomycin与MS的作用方式完全不同于阳性对照4-苯基丁酸。 通过AutoDock Vina program (1.0 beta版)软件，对MS和Echinomycin进行了分子对接模拟实验，二者之间的最低结合能量为-9.0 Kcal/mol，证明了MS与Echinomycin结合后形成复合物的高度稳定性。我们的研究表明MS是一个非常有希望的抗结核药物筛选靶标，对Echinomycin与MS的相互作用进行深入的研究有助于指导我们设计研发出更多有潜力的抗结核药物。另外，通过本课题研究，我们用BCG模型对本实验室天然产物库进行了部分筛选，选择了15个活性菌株进行放大发酵及纯化合物的分离，得到34个代表性的纯化合物，其中新化合物10个，具有抗BCG及抗结核活性的化合物10个， 具有MS强抑制活性的化合物1个。在此过程中还发现两个actinomycins 和echinomycin 高产菌株。课题已申请国家专利3项，发表SCI文章8篇。