以炭疽芽孢杆菌A16为被检菌,A16R为参照菌,进行抑制消减杂交,获得消减文库,从中筛选差异DNA片段,根据炭疽芽孢杆菌Ames基因组序列确定两菌的差异基因,并用PCR和Southern杂交进一步验证。提取炭疽芽孢杆菌A16和A16R芽孢、繁殖体、培养上清的蛋白,进行多种不同PH梯度的双向电泳,确定并挑取差异蛋白质点进行质谱分析,鉴定差异蛋白。结合已确定的差异基因,进行补充和验证,最终全面确定炭疽芽孢杆菌A16和A16R之间的差异基因。本项目的研究结果,可以全面认识我国人用炭疽疫苗株A16R的分子遗传学背景,为进一步改进A16R疫苗株,提高其免疫效果,奠定坚实的理论基础。同时,也可以为炭疽芽孢杆菌的分子致病机理提供新的认识。
炭疽是重要的人畜共患传染病,炭疽芽孢杆菌一直被作为首要的生物战剂和生物恐怖病原。A16R是来源于A16的我国人用炭疽疫苗株。本项目一方面以炭疽芽孢杆菌A16为被检菌,A16R为参照菌,进行抑制消减杂交,获得消减文库,并通过Southern杂交、PCR扩增以及最终的序列分析得到了9个差异片段,经BLAST检索比对显示这9个片段均位于pXO2质粒上,验证了A16R丢失了pXO2质粒,没有找到染色体上的差异;另一方面建立了A16R对数生长中期全细胞蛋白不同pH梯度的双向电泳参考图谱,对表达丰度较高的534个蛋白质点进行了质谱分析,最终鉴定了对应于299个编码基因的406个蛋白质点,在实验中证实了27个"假想蛋白"的表达,并在国内外网站上建立了相应的数据库,在此基础上开展了A16和A16R的比较蛋白质组学研究。由于P3实验室内各种操作条件的限制,一直无法建立重复性和得率均很好的A16蛋白样品制备方法,所以尽管初步得到了一些关于A16和A16R差异表达的数据,但仍有待大量实验验证。