中文摘要：

抗氧化蛋白酶在洗涤剂行业有重要应用价值。传统上来自芽孢杆菌属的丝氨酸蛋白酶是抗氧化蛋白酶的主要来源，其研究方法大多停留在对基本酶学性质的描述。海洋低温蛋白酶MP是本实验室筛选的一种金属蛋白酶，其在特定条件下能与4%的双氧水作用一小时，残留酶活可以达到85%，抗氧化性能十分显著。目前该低温蛋白酶已经由I 型蛋白分泌系统为介导在大肠杆菌中进行了活性表达，并培养得到了蛋白晶体。本项目拟通过解析蛋白酶MP的晶体结构，分析与蛋白酶抗氧化功能相关的位点；采用定点突变和定向进化相结合的分子生物学方法，获得不同的蛋白酶突变菌株；研究突变菌株的酶学性质，分析其结构与功能的关系，从而阐明蛋白酶MP的抗氧化性机制，为进一步拓展海洋低温抗氧化蛋白酶MP的应用领域打下基础。

结论摘要：

抗氧化蛋白酶在洗涤剂行业有重要应用价值。 2012年度完成了蛋白酶晶体结构解析、I型分泌系统介导的蛋白酶MP的定点突变及定向进化方法中突变文库的构建。由蛋白酶MP的晶体结构已解析数据可知，其由463个氨基酸残基组成，包括1个Zn2+和8个Ca2+；蛋白酶MP的活性位点由锌离子和几个组氨酸以及226位点的酪氨酸组成，活性位点周围有一个甲硫氨酸，经结构解析，该位点可能与其较强的抗氧化性相关。采用定点突变的方法，将该位点的甲硫氨酸进行了突变，实验结果表明蛋白酶MP的抗氧化活性提高了10%，说明该位点与蛋白酶MP的抗氧化性相关，但可能还受到其它氨基酸残基的影响。采用重叠PCR法，又对甲硫氨酸附近的组氨酸和苏氨酸进行了突变，实验结果表明，这两个位点的突变都未对蛋白酶MP的抗氧化活性产生影响，要揭示其真正的抗氧化机制，必须进行随机突变，获得更多的突变子。之后已分别采用易错PCR、DNA Shuffling、RAISE的方法分别构建了突变文库，文库容量达到105。 2013年度，我们将突变文库的基因片段连接到I型分泌系统介导的蛋白酶的表达系统中进行了蛋白酶MP的突变子的活性表达。由于突变子文库容量较大，我们建立了高效的酶标仪和双层平板筛选法筛选高活性的抗氧化蛋白酶突变株。已经筛选出抗氧化活性高于原始菌株1.5-2.0倍的菌株8个，高于原始菌株2.0-3.0倍的菌株6个，高于原始菌株3.0-5.0倍的菌株5个。分别将突变菌株进行序列测定, 所筛选到的19个突变菌株均是在活性中心附近的甲硫氨酸发生了突变，不同活性的菌株又有其它不同氨基酸发生了突变。实验结果表明活性中心附近的甲硫氨酸对蛋白酶MP的抗氧化活性有很大影响。 2014年度，将前期获得的19个抗氧化蛋白酶的突变体进行了蛋白纯化，研究了突变菌株的酶学性质，并与野生型菌株的酶学性质进行了对比。突变体的抗氧化功能与前期进行粗酶筛选的结果一致。因此，我们可以得出结论海洋低温蛋白酶MP的抗氧化功能与已知的芽孢杆菌属来源的蛋白酶相似，均是活性中心附近的甲硫氨酸对其抗氧化功能影响显著。另外, 根据突变体蛋白的三维空间模拟图可知，由于空间位置的关系，其它氨基酸的突变增加了蛋白的空间位阻，同时隔绝了氧化剂与活性中心的结合，从而提高了突变菌株的抗氧化活性，揭示了海洋低温蛋白酶MP的抗氧化机制。