中文摘要：

磷酸二酯酶（PDEs）抑制剂可以通过抑制细胞内重要第二信使cAMP/cGMP的水解而治疗如勃起功能障碍、哮喘、心血管等多种疾病。然而，不同PDE蛋白酶对抑制剂和底物cAMP/cGMP的识别机制尚不明确，成为当前PDE特异性抑制剂设计的主要障碍。我们近期实验发现野生型PDE9A只能识别cGMP，经双重突变(E406P/A452S)后，也能识别cAMP，但具体的作用机制还不明确。本课题拟在申请人已有的工作基础上，选择抗糖尿病新靶标PDE9A为研究对象，采用分子模拟技术将底物结合口袋中特有残基虚拟突变成与其它亚型相应的残基，研究各虚拟突变对配体识别能力的影响，从而鉴定出有关键作用的残基，并以点突变、活性测试和蛋白晶体学方法进行验证。本课题将阐明PDE9A识别特异性配体的作用机制、保守残基在识别过程中的重要作用，为基于晶体结构的PDE9A特异性抑制剂设计提供理论依据。

结论摘要：

PDE9A是新型抗糖尿病和老年性痴呆药物的作用靶点，备受大制药公司的关注，而辉瑞PDE9A抑制剂PF-04447943已于近期完成Ⅱ期的临床试验。在项目执行期，项目组已建立以PDE9A为作用靶标的II型糖尿病药物筛选平台。a）项目组通过分子模拟和生物化学方法，鉴定出六个残基（F456、Q453、Y424、L420、I403、A452）是PDE9A识别特异性抑制剂的重要残基，主导对PDE9A特异性抑制剂的识别机制；而多种因素联合决定了PDE9A对底物cGMP/cAMP的识别机制。b）项目组通过蛋白质晶体学方法，获得PDE9A选择性特异性抑制剂3r（IC50 = 0.60 nM, PDE9A 对 PDE1选择性为788倍）与PDE9A的晶体结构，发现Y424与3r的存在较强氢键作用，确证该残基决定了PDE9A对3r的选择性识别机制；A452与3r的氢键作用进一步提高3r的抑制活性。c）此外，还通过HepG2细胞实验，项目组发现3r有明显的降糖效果（本研究超出项目的计划），抑制剂3r 有望发展为抗糖尿病药物先导化合物。d）在本项目资助下，申报人以通讯作者和第一作者发表SCI论文19篇和1篇（共20篇，影响因子大于5的五篇，项目合同书计划发表SCI论文3-5篇）；共申请化合物国内发明专利2项；培养4个硕士研究生；申报人晋升为教授。