中文摘要：

甘露聚糖是一种广泛存在于植物细胞壁中的半纤维素类多糖，饲料中的甘露聚糖能够引起动物的抗营养作用，影响营养物质的消化和吸收。在饲料中添加β-甘露聚糖酶是解决甘露聚糖抗营养作用的重要手段。在现有研究工作的基础上，纯化硫色曲霉产β-甘露聚糖酶和细菌表达的重组酶，进行酶学特性比较分析；在原核表达载体上，定点突变分析，确定酶的催化区、底物结合区和结构稳定区，定位关键氨基酸残基的位点，从而阐明酶催化的分子机理；利用基因重组技术，对酶的分子结构进行改造以提高热稳定性；构建毕赤酵母高效分泌表达的基因工程菌株，对发酵条件进行摸索。所获得结果不仅可以为β-甘露聚糖酶的工业化生产奠定基础，而且可以为类似的蛋白质工程研究提供重要的科学依据。

结论摘要：

构建表达载体pET-28a(+)-mann转化大肠杆菌BL21，重组菌株经IPTG诱导，用12% SDS-PAGE检测，可见目的蛋白的特异性表达。纯化的表达产物变性、复性处理后，获得有活性的β-甘露聚糖酶蛋白，蛋白表达量为25 mg/L，酶活力为5.2 U/mL。酶学性质分析表明，重组β-甘露聚糖酶最适反应温度为50℃，最适pH值为2.4，在pH 2.2-8.0和40℃以下有很好的稳定性。定点突变分析证明β-甘露聚糖酶的E206和E314是酶的催化位点。构建了毕赤酵母诱导型表达载体pPICZαA-MANN，转化酵母X-33感受态细胞。重组菌经PCR和Southern-blot结果表明，该基因稳定地整合到了酵母基因组DNA中，并且具有很好的遗传稳定性。利用甲醇诱导，实现了β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达。表达产物为48 kDa的糖基化蛋白，重组蛋白表达量为262 mg/L，酶活为96 U/m。重组甘露聚糖酶动力学分析表明，Km值和Vmax分别为0.93 mg/mL和344.83 U/mg。重组酶对多种金属离子及化学试剂具有较好的耐受性，该蛋白的等电点为4.89。