中文摘要：

感染是膈肌无力的重要原因之一，但对其认识匮乏，分子机制更鲜有研究。预实验表明内毒素处理小鼠后膈肌中活性PKR和上游MAPK激活剂MEK3/6显著增加，而这种变化的方式与Caspase转导通路的激活一致。拟建立小鼠膈肌和肌细胞感染模型，采用Western印迹，酶活性测定，流式细胞检测和膈肌肌力测量等方法，探讨感染致膈肌肌力下降与Caspase、P38等分子的关系；运用化学和基因抑制剂进一步确认其在肌肉功能障碍中的作用。p38与细胞生长有关，直接用siRNA沉默后肌细胞无法分化成熟，影响进一步研究。为此培育出新一代p38转基因小鼠，将终止密码、Cｒｅ-Lｏｘｐ与负显性基因（DN）有机结合，定时定点控制肌细胞DN基因表达, 克服RNAi之不足，开创肌细胞模型中重要基因功能研究的新路径。预期找到感染造成的隔肌细胞功能障碍与p38通路的关系，从分子水平探讨感染引起膈肌肌力下降的机理和可能的防治策略。

结论摘要：

本项目达到了预期的研究目标，取得了比较好的结果。成果如下败血症是最常见的感染性疾病之一， 也是住院病人中死亡的主要原因之一。严重的败血症占进入ICU治疗的病人中的1/5，也是非心脏病ICU中病人的一个主要的死亡原因。败血症除了造成心肝肾等器官的衰竭外, 还能够引起骨骼肌的严重和持续性改变。研究发现全身感染炎症是继发膈肌肌无力的最重要的原因之一，但其机制也不清楚，相关研究也鲜有报导。实验表明，内毒素处理小鼠后膈肌中活性PKR和上游MAPK激活剂MEK3/6显著增加，而这种变化的方式与Caspase转导通路的激活一致。我们发现，p38与细胞生长有关，直接用siRNA沉默后肌细胞无法分化成熟，或者细胞死亡，生长缓慢，因而后续的实验无法进行。为此培育出新一代p38转基因方法，将终止密码、Cｒｅ-Lｏｘｐ与负显性基因（DN）有机结合，定时定点控制肌细胞DN基因表达, 克服RNAi之不足，开创了肌细胞模型中重要基因功能研究的新路径。这种独创的第三代转基因技术，我们称之为CRE-LOXP-STOP-DN转基因系统。以内毒素感染小鼠模型为基础，以肌肉细胞系C2C12细胞感染模型为辅助，通过化学抑制剂证明了感染时膈肌肌力下降的机制主要与Casapase激活有关，感染后小鼠膈肌/C2C12细胞主要是Casapase 3、8 而非Casapase 9被激活， 而且caspase 3并不能引起肌肉细胞凋亡。采用了二种p38抑制剂, 即化学抑制剂--SB203580与上述首创的基因抑制剂----CRE-LOXP-STOP-p38DN; 结果提示，抑制p38能够有效地减少肌肉收缩蛋白的分解，提高膈肌收缩的肌力；p38可能是有效的药物控制靶点。结果表明,感染状态下小鼠膈肌无力的主要信号转导通路是p38转导通路，运用该基因和蛋白质的基因抑制和蛋白质抑制剂， 可以阻止感染后小鼠膈肌蛋白质的分解，提高膈肌收缩功能，促进肌力恢复。根据上述结果，提出如下的假设感染刺激免疫细胞，甚至肌肉细胞分泌细胞因子，如TNF、 IL-2等。细胞因子进一步促进NADPH氧化酶和RAX等的应激反应。然后循p38信号转导途径， 与死亡受体结合，提高死亡受体的活性，上调Caspase 8和Caspase 3, 促进肌肉收缩蛋白的裂解，肌力出现下降。