mig-14是沙门菌属水平转移获得的毒力基因,受Phop调节,参与伤寒沙门菌抗多粘菌素B等多种抗菌肽作用,有研究显示其并不影响脂多糖修饰,具体机制尚不明确。序列分析及本室前期工作均提示Mig-14可能是一种调节因子,因此我们推测,Mig-14有可能通过作用于耐药相关基因或蛋白质而实现伤寒沙门菌对抗菌肽的拮抗作用。本研究拟采用基因芯片技术,分析多粘菌素B刺激条件下mig-14缺陷株表达谱变化,重点关注耐药相关基因;运用蛋白表达、凝胶阻滞等试验,进一步验证Mig-14对耐药相关基因表达的调节作用;制备抗Mig-14抗体,结合应用免疫共沉淀及质谱分析技术,寻找与Mig-14相互作用的靶蛋白,以深入探讨Mig-14参与伤寒沙门菌耐多粘菌素B的分子机制。本研究将会丰富对伤寒沙门菌耐药机制及基因表达调控网络的认识,同时为新药研发提供新的靶点。
S. Typhi;Mig-14;PB;drug resistance;gene expression profile
mig-14是沙门菌属水平转移获得的致死毒力基因,受Phop调节,其分子功能尚未澄清。有报道称Mig-14参与伤寒沙门菌耐PB等多种抗菌肽的杀伤作用,但并非通过直接修饰脂多糖结构而实现,其具体机制尚不明确。序列分析显示Mig-14具有DNA结合蛋白同源序列。本研究通过基因芯片表达谱分析技术初步证实Mig-14是一种调节蛋白,高渗应激条件下可调节多种基因的表达并促进伤寒沙门菌侵袭进入宿主细胞,Mig-14只有具备完整序列的条件下方可发挥其调节功能。基于此,本研究比较了PB刺激下,野生株和mig-14缺陷株的表达谱差异,发现鞭毛相关基因,编码孔道蛋白基因ompC,ompF明显上调;Δmig-14下调基因主要为侵袭及毒力相关基因、毒力岛-1效应蛋白基因,Δmig-14中未知功能蛋白t1642,t1643,t1830,t2036的表达与野生株相比下调16倍以上。根据表达谱结果,本研究比较了伤寒沙门菌野生株和Δmig-14的动力,侵袭能力,巨噬细胞的存活能力以及生物膜的形成能力的差异,发现野生株的侵袭能力,巨噬细胞的存活能力均强于Δmig-14,但其动力及生物膜的形成能力低于Δmig-14,具体机制及功能有待进一步研究。Δmig-14中,孔道蛋白基因ompC,ompF明显上调,本研究因此构建了ompF缺陷株,ompC缺陷株,ompF-mig-14,ompC-mig-14双缺陷株,及ompF-omp-mig-14三缺陷株,比较各菌株之间耐PB的能力,发现PB条件下,单缺失ompF及ompC对生存能力影响不大,但缺失mig-14后,生存能力明显降低,再缺失ompF或/和ompC后,生存能力有所提高,但并未达到野生株水平。本研究同时还表达了Mig-14蛋白胞内部分及周质空间部分,制备了相应多克隆抗体,但并未获得直接作用的证据。综上所述,Mig-14耐PB的机制有1、通过抑制ompF和ompC的表达关闭外膜孔道防止PB进入胞内;2、高表达SPI-1,SPI-2相关基因,增加其毒力抵制PB的杀伤作用;3、抑制鞭毛相关基因的表达降低宿主细胞的免疫应答反应抵制PB的杀伤作用;4、通过未知功能蛋白t1642等的直接作用而耐药,具体机制仍需进一步研究。本研究初步得出Mig-14参与伤寒沙门菌耐PB的作用机制,拓宽了伤寒沙门菌基因表达调控网络,为新药的研发提供了一些新的靶点。