中文摘要：

叶绿体基因工程是高效表达外源蛋白的有效途径之一，翻译效率是决定其表达能力的重要因素。T7噬菌体基因10前导序列(g10-L)已被证实可以作为翻译增强子有效提高翻译效率。本研究以含有巨大杯状叶绿体的单细胞真核生物-杜氏盐藻为材料,构建含抗性基因和经过密码子偏好性改造的荧光素酶融合基因(LuxAB)为报告基因及相关驱动原件(启动子、5′和3′UTR)的叶绿体转化质粒。以此为基础构建Kringle 1-5叶绿体表达载体，并在5′和3′UTR上下游不同位置分别添加g10-L序列。基因枪转化，筛选同质化的转化藻株并分析融合基因在分子和蛋白水平的表达情况，证实g10-L序列的翻译增强作用。鉴定Kringle 1-5的生物活性，为建立高效表达具有生物活性外源蛋白的盐藻叶绿体转化系统奠定

结论摘要：

翻译效率是决定叶绿体基因工程中外源蛋白表达的重要因素之一，T7噬菌体翻译增强序列(g10-L)可以有效增强翻译效率，提高外源蛋白在叶绿体中的表达。本研究主要取得结果如下 1）在已有叶绿体表达载体LuxCt的基础上，将目的蛋白LuxCt基因成功置换为血管抑素Canstatin基因，形成目的基因表达盒为atpA 5’UTR-Canstatin-RbcL 3’UTR的叶绿体转化载体。在表达盒的5’UTR-上游和3’UTR下游分别成功添加翻译增强序列，通过转化大肠杆菌，成功表达目的蛋白Canstatin，Western blotting 结果证实该目的蛋白具有特异性。 2）在atpA 5’UTR-Canstatin-RbcL 3’UTR表达盒基础上，通过PCR等方法分别在5’UTR上游、3’UTR下游、5’UTR下游、3’UTR上游以及同时在5’UTR上游和3’UTR下游引入翻译增强序列，并全部连入T载体。将5’UTR-上游和3’UTR下游分别成功添加翻译增强序列的Canstatin叶绿体表达载体以及上述T载体均转化大肠杆菌，通过Western blotting检测均可检测到目的蛋白Canstatin的特异性表达，并且由于插入位点的差异，蛋白表达量也有所差异，初步证实g10-L翻译增强序列对外源蛋白的表达具有增强作用。 3)以杜氏盐藻chlN基因片段为同源臂，成功构建pUC-chlN- CAT杜氏盐藻叶绿体的同源重组转化载体，同时将上述翻译增强表达盒分别与该载体连接，并进行杜氏盐藻叶绿体转化，氯霉素抗性筛选阳性转化藻株。实时荧光定量PCR结果说明转化株的mRNA水平无明显差异，但Western blotting结果表明，翻译增强序列在表达盒的不同位置能够引起外源蛋白Canstatin含量的差异，这就再次证明翻译增强序列在叶绿体转化体系中，能够通过翻译增强的功能来提高蛋白表达量。但是，稳定转化株和叶绿体同质化的转化株尚未能获得，限制了对该转化体系和翻译增强序列功能的深入研究。 本基金项目共资助发表SCI收录论文2篇，中文核心期刊论文4篇，培养博士研究生1名，硕士研究生3名。