中文摘要：

上一课题(30672069)研究证实Apoptin-来源于鸡贫血病毒的一种小蛋白，能够特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡，而对正常肝细胞无凋亡诱导作用。MAP4K4是一种丝苏氨酸蛋白激酶，与Apoptin存在特异性结合位点。我们实验发现MAP4K4在肝脏肿瘤的表达水平高于肝正常组织，结合相关文献作出推测MAP4K4可能使Apoptin磷酸化，及其后的Apoptin发生多聚化并与某些蛋白质结合，形成蛋白质复合体移位至细胞核，进入细胞核的复合体与核内的DNA结合影响DNA有效转录合成，诱导肝脏肿瘤细胞凋亡？本课题拟通过调节MAP4K4表达水平，观察其对Apoptin特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的影响及相关蛋白的改变，研究MAP4K4及其下游分子在Apoptin特异性诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的作用。阐明Apoptin诱导肝脏肿瘤细胞凋亡的分子机制，为探寻新的肿瘤标志物，并开展以此为靶标的肿瘤诊疗奠定基础。

结论摘要：

肝癌是全球范围最常见的恶性肿瘤之一。由于缺乏早期特异性诊断及有效治疗手段导致传统的抗肝癌治疗受到极大限制。基因治疗是近十年来逐渐发展起来的抗肿瘤策略，越来越多的实验证明其具有广阔的临床应用前景。目前，寻找特异而有效的新型靶向抗肿瘤分子，阐明其抗肿瘤分子机制已成为基因治疗的关键。来源于鸡贫血病毒（Chicken anemia virus, CAV）的凋亡诱导蛋白Apoptin，能够特异性诱导多种恶性肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡，而对正常或原代细胞无杀伤作用。目前已证实Apoptin对肝癌HepG2细胞的特异性凋亡作用。然而，Apoptin选择性杀伤肝癌的作用机制目前还不明确。本课题进一步研究Apoptin对肝癌细胞特异性诱导凋亡的作用机制，对其作为新型选择性抗肝癌分子奠定理论和实践基础。本课题探讨CDK1在Apoptin特异性诱导肝癌HepG2细胞凋亡过程中的作用机制，初步揭示CDK1在Apoptin介导肝癌细胞调亡中可能的作用。本课题运用分子生物学技术构建稳定表达Apoptin蛋白的pEGFP-Apoptin及pcDNA3.1-Flag-Apoptin两个重组表达载体。运用RNA干扰技术下调细胞周期蛋白CDK1表达水平。通过荧光定量PCR 和 Western Blot 检测临床收集48对肝癌及癌旁组织标本中CDK1的表达情况。拟选用肝癌HepG2细胞株及人正常肝细胞HL-7702细胞为研究对象，首先应用MTT法及免疫荧光进一步验证Apoptin对肝癌HepG2的特异性杀伤作用及亚细胞定位。其次应用Annexin V-PE/7-AAD染色法流式细胞术、MTT法，观察测定CDK1表达水平的变化对Apoptin特异性诱导肝癌HepG2细胞凋亡的影响；免疫共沉淀对比分析在Apoptin诱导肝脏肿瘤细胞凋亡过程中，CDK1是否与其相互结合或相互作用；免疫荧光法检测在随着CDK1蛋白表达水平变化的同时，Apoptin在肝癌HepG2细胞中亚细胞定位的变化。