中文摘要：

MAPK 通路和GPCR通路是两条极其重要的信号转导通路，其异常激活或抑制都可能引发很多疾病，如阿尔茨海默氏症、前列腺癌等。Raf激酶抑制蛋白RKIP，可以交叉调控MAPK通路和GPCR通路，但其分子机制和结构基础尚不清楚。已有的研究工作表明RKIP蛋白通过与Raf1蛋白相互作用，调控MAPK 通路；当RKIP蛋白磷酸化后，脱离Raf1，转而与Grk2蛋白结合，从而调控GPCR通路。本项目拟在前期工作的基础上，采用异核多维NMR技术，测定人RKIP蛋白磷酸化前后的三维结构和动力学，并研究RKIP蛋白与Raf1蛋白,以及磷酸化后的RKIP蛋白与Grk2蛋白的相互作用，阐明它们的结合位点、结合强度和相互作用机制，并比较RKIP 磷酸化前后的结构和动力学差异，揭示RKIP交叉调控MARK通路和GPCR通路的分子机制和结构基础，为研发治疗信号转导通路异常相关疾病的药物提供新的思路和潜在的靶点。

结论摘要：

本项目采用异核多维NMR、圆二色、荧光等谱学方法揭示了RKIP交叉调控MARK通路和GPCR通路的分子机制和结构基础。首先，制备了同位素标记（15N/13C）的RKIP蛋白样品，完成了RKIP蛋白的主链和侧链共振信号的归属，化学位移数据已存入BMRB数据库（accession code 16992）。并且测定了RKIP蛋白的溶液结构，三维结构的坐标数据已存入PDB数据库（accession number 2L7W）。hRKIP 蛋白溶液结构与已报道的晶体结构极其相似，两者在二级结构区域的主链CA 原子的均方根偏差为 1.2？。hRKIP 蛋白的主链动力学分析表明，hRKIP总体序参数的平均值为0.89，整体结构比较刚性，有着一个比较好的球形结构。处于结合口袋底部和顶部的氨基酸（T69、W84、Y120 、D175）存在微秒-毫秒时间尺度的慢交换。其次，制备了RKIP (S153E)突变体来模拟磷酸化的RKIP，热稳定性和脲稳定性结果均显示突变体RKIP(S153E) 比野生型RKIP的稳定性有所下降。2D 1H-15N HSQC实验表明，S153E 突变使得RKIP配体结合口袋和“loop127-150” 区的构象有所改变。动力学实验分析表明， S153E 突变体的内部柔性比野生型有所增加，尤其是C 端螺旋上的171~ 182 残基的变化比较大。S153E突变体构象和动力学的变化使得RKIP的配体结合特性发生了改变。荧光滴定实验表明， S153E突变体结合配体PE的能力提高了大约1倍，而且S153E突变体不仅可以结合Raf1蛋白，也可以结合Grk2蛋白，说明S153E突变体已经具备磷酸化RKIP的性质。核磁滴定实验表明， RKIP是通过改变配体结合口袋和“loop127-150”区的构象来协调与Raf1， Grk2，以及配体的相互作用。这些工作为阐明RKIP交叉调控MARK通路和GPCR通路的分子机制提供了理论基础。此外，我们以RKIP的配体结合口袋为活性中心，通过计算机模拟，筛选出四种可以与RKIP蛋白相互作用的药物分子，结合常数分别为3.6 ？M, 2.32 ？M, 0.74 ？M, 5.17 ？M。目前正在进行这些配体对RKIP与Raf1， 以及RKIPS153E与Grk2相互作用的干扰实验。