中文摘要：

雷莫拉宁是由放线菌产生的抗临床难以控制和治疗的MRSA和VRE感染的重要糖肽类抗生素，目前正处于Ⅲ期临床研究，预计即将上市。在对雷莫拉宁生物合成基因簇的研究中，没有发现糖基转移酶基因，这与其结构中含有两聚甘露糖基团不符，也与已知的其他许多糖肽类抗生素的生物合成不同，这是一个有待解答的科学问题。利用已公布的mannopeptimycins生物合成基因簇中的甘露糖基转移酶基因序列，或其他已经公布的甘露糖基转移酶基因序列，设计简并引物克隆雷莫拉宁生物合成中的甘露糖基转移酶基因，确定其基因定位；并通过体内基因敲除和体外克隆表达等方法，研究该酶的功能与底物宽泛性。通过这个科学问题的解答，能够进一步阐明雷莫拉宁的生物合成机制。在确定该酶基因定位和功能的基础上，通过不同糖肽类抗生素产生菌遗传操作系统的建立，构建产生带有不同糖基的"杂合糖肽类抗生素"工程菌，为获得具有自主知识产权的创新药物打下基础

结论摘要：

雷莫拉宁是由放线菌产生的抗临床难以控制和治疗的MRSA 和VRE 感染，以及由艰难梭菌引起的腹泻的重要糖肽类抗生素，目前正处于Ⅲ期临床研究，预计即将上市。通过本项目的研究，解答了作者在雷莫拉宁产业化开发的过程中发现的“参与雷莫拉宁生物合成糖基转移酶基因定位和功能”的科学问题。本项目从四个方面着手，确定了参与雷莫拉宁生物合成糖基转移酶基因的定位及揭示了其功能一是通过对雷莫拉宁生物合成基因簇进行分析，结合已知的结构中含有甘露糖的糖肽类抗生素生物合成途径中的糖基转移酶信息，我们推测ramo-orf29为雷莫拉宁生物合成过程中编码糖基转移酶的基因；二是通过异源表达、体外糖基转移酶活性和底物宽泛性研究，以及体内基因中断试验等来研究参与雷莫拉宁生物合成的糖基转移酶的功能，最终确定了ramo-orf29为雷莫拉宁生物合成途径中唯一的糖基转移酶；三是在构建的ramo-orf29 敲除突变株A.CJS1001 发酵液中发现Hpg13 卤化的2-Cl雷莫拉宁苷元，而在野生型发酵产物中并未发现有2-Cl雷莫拉宁产生；四是将Ramo-orf29通过同源重组单交换位点特异性整合至恩拉霉素产生菌ATCC 21013中进行异源表达，构建得到突变株A.CJS2001，突变株发酵产物中检测到单糖恩拉霉素系列产物，说明Ramo-orf29 能够识别并催化恩拉霉素肽骨架的糖基化。较好地完成了项目设定的研究目标。与此同时，我们还构建了雷莫拉宁产生菌SIPI-A.2006基因组文库和基因组测序；将恩拉霉素生物合成过程中唯一的卤化酶End-orf30分别在雷莫拉宁产生菌卤化酶敲除突变株、野生型、糖基转移酶敲除突变株中进行异源表达；首次证明了雷莫拉宁生物合成基因簇中的反式作用蛋白Ramo-orf17参与雷莫拉宁的NRPS途径，并发现这个NRPS蛋白的N端区域在雷莫拉宁的生物合成中起关键作用；重构雷莫拉宁脂肪酸侧链的合成途径，将其中关键步骤的基因替换为恩拉霉素基因簇中的相应基因，获得了脂肪酸侧链长度改变的雷莫拉宁衍生物，其中比雷莫拉宁A3的脂肪酸侧链多一个CH2单元的衍生物X1的抑菌测试显示其保留了雷莫拉宁A2 的良好抑菌活性；开展了万古霉素糖基转移酶GtfE对雷莫拉宁苷元体内外糖基化的研究，这些基础的研究为获得新的杂合糖肽类抗生素奠定了基础，具有潜在应用价值。