中文摘要：

慢性神经痛的治疗是医学界的难题。我们前期研究证实转基因细胞移植镇痛是慢性疼痛治疗的新策略，而筛选携带镇痛基因的理想载体细胞和镇痛效能的调控与维持是这一治疗领域的新难题。研究发现具备取材方便和多向分化潜能的BMSCs是目前基因治疗的理想载体细胞。由此我们首次拟以BMSCs作为基因转移的载体细胞，通过遗传修饰构建人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）永生化的BMSCs细胞系hTERT-BMSCs；采用逆转录病毒表达和克隆筛选技术，建立受Dox高效调控表达甘丙肽的智能型细胞系hTERT-BMSCs/Tet-on/GAL；细胞移植大鼠慢性神经痛模型后，观察移植细胞的迁移、定位、分化、活力、以及外源基因受Dox的表达调控，评价并探讨其用于可控性镇痛的可行性及作用机制。GAL和hTERT基因修饰的BMSCs联合Tet-on基因表达调控系统的应用有望解决细胞移植镇痛临床应用的"瓶颈"，使广大疼痛患者获益。

结论摘要：

慢性神经痛的治疗是医学界的难题，理想载体细胞的选择和镇痛效能的调控与维持是这一治疗领域的关键问题。本研究通过移植具有多向分化潜能和可控性分泌甘丙肽（GAL）的永生化骨髓间充质干细胞（BMSCs）来研究其用于可控性镇痛的可行性。1、人端粒酶逆转录酶基因（hTERT）永生化BMSCs细胞系hTERT-BMSCs的构建与鉴定。结果发现hTERT基因修饰的BMSCs可以体外连续培养30代以上，与对照细胞相比，hTERT-BMSCs细胞hTERT mRNA表达、端粒酶活性以及细胞增殖能力均提高，细胞周期主要处于G2/M以及S期；细胞表面分子CD29、CD44、CD90表达阳性率大于70%，而CD34、CD45表达阳性率不足5%，胞浆Nestin的表达阳性，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ未见表达，保留了干细胞成骨、成脂、成神经的分化能力，染色体核型正常，无致瘤性。2、建立受强力霉素（Dox）高效调控表达甘丙肽的智能型细胞系hTERT-BMSCs/Tet-on/GAL。结果发现，将携带有大鼠GAL的单载体Tet-on诱导调控慢病毒系统（pLV.TetⅡP-GAL-EGFP-/Ubi-TetR）转染hTERT-BMSCs细胞，经筛选后，获得稳定的hTERT-BMSCs/Tet-on/GAL细胞株；通过设定不同浓度Dox体外诱导，观察EGFP和甘丙肽的表达，结果显示该细胞株对诱导剂Dox敏感，10ng/ml Dox即可诱导甘丙肽的表达，在1000ng/ml Dox达最大诱导表达量，虽然存在少量背景表达，但该细胞株的目的基因的表达可以严格受诱导剂Dox的调控，且所需诱导剂量小，诱导效率高，达到“智能化”细胞的目的。3、大鼠慢性神经病理痛模型的建立，蛋白激酶PKMζ的表达，以及移植细胞的可控性镇痛作用和机制。脊髓背角蛋白激酶PKMζ的表达与慢性疼痛的维持有关, 鞘内或静脉注射细胞后，运动平衡功能没有变化，而且能产生明显的长效镇痛作用，大鼠缩爪阈值随着Dox的给予明显提高，且受Dox的量效性调控，外周注射细胞归巢至腰段脊髓。非特异性拮抗剂M35可逆转其镇痛作用；大鼠脑脊液中GAL的含量、脊髓GAL及GALR1的表达升高、PKMζ的表达降低与Dox诱导后动物行为学变化相关。结果提示鞘内移植hTERT-BMSCs/Tet-on/GAL细胞可以发挥可控性地镇痛的效用，避免外源基因持续表达带来的副作用。