中文摘要：

感染HBV基因型B和C的CHB患者在临床表现上存在很多差别，感染基因型B的患者常较早发生HBeAg的血清学转换，感染基因型C的患者常发生严重的终末期肝病和肝细胞肝癌。我们前期研究发现，这两种基因型体外转染时在基因组复制和RNA转录等分子生物学特性方面也存在较多差异在未发生RT区和BCP区突变的HBV分离株中，B基因型HBV的基因组复制能力明显强于C基因型；Northern Blot分析结果显示这两种基因型在转录水平上也存在同样的差别。我们推测这种差别可能与转染过程中HBV cccDNA的形成或内源性聚合酶的活性相关。本课题拟在前期研究工作的基础上，采用HBV cccDNA检测试剂盒及Southern Blot的方法检测转染肝细胞内的HBV cccDNA形成的数量，并采用同位素掺入电泳放射自显影的方法检测HBV内源性聚合酶活性，深入分析影响B基因型和C基因型HBV复制差异的分子机制。

结论摘要：

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染可以导致慢性乙型肝炎，肝硬化和肝细胞肝癌。HBV可以分为9种基因型并细分为基因亚型，我国主要是B和C型（其中最常见的基因亚型为B2和C2)。这两种基因型在对干扰素的治疗反应、肝硬化和肝细胞肝癌的发生风险方面存在显著的不同。为了更好地理解产生这种临床差异的原因，我们对这两种基因型的分子生物学特性及其机制进行了系统深入的研究。前期关于HBV基因型B和C（主要是基因亚型B2和C2）的分子生物学特性的研究中，我们发现启动子区未发生突变HBV基因型C2的基因组复制能力和3.5kb RNA的转录活性均显著弱于基因型B2。本研究中，我们通过引物延伸的方法，进一步发现3.5kb RNA的差异主要表现为pg RNA而不是pc RNA的差异，pg RNA参与HBV核心蛋白和聚合酶的表达，其转录主要受核心启动子（core promoter，CP）和增强子（Enhancer I，ENI和Enhancer II，ENII）的调控。我们在HBV双体中扩增含有HBV ENI或/和ENII或/和CP的片段，插入pGL2 Basic Vector 或pGL3 Promoter Vector中构建报告质粒。瞬时转染Huh7细胞，转染后采用双荧光报告系统试剂盒分析报告质粒的Fluc/Rluc的活性。我们发现（1）HBV 基因型B2 ENI/ENII/CP的活性显著强于基因型C2；（2）HBV 基因型B2 ENII/CP的活性显著强于基因型C2；（3）HBV nt1633, 1635, 1636 and 1652核苷酸序列的差异是基因型B2和C2 ENII/CP的活性差异的主要原因。为了分析ENII/CP的差异对这两种基因亚型复制活性的影响，我们在B2和C2基因型HBV双体中分别交换HBV ENII/CP片段，转染结果显示交换ENII/CP片段后，HBV基因型B2的复制能力较前明显减弱，相反的，C2的复制能力明显增强。 HBV nt1633, 1635, 1636和1652位核苷酸序列的差异可能是基因型C2 ENII/CP转录活性和病毒基因组复制能力低于B2的主要原因。病毒的低复制可能直接导致基因型C2免疫清除的延迟，也可能直接促进了核心启动子区的突变，该突变可以增强HBV的复制能力并进一步导致肝细胞肝癌的发生。