中文摘要：

四膜虫（Tetrahymena）是一种非致病性的纤毛虫，国外许多研究结果表明其可作为一种理想的表达细胞，具有目前所知的其他真核或原核生物无法媲美的优越性。本课题以四膜虫为研究对象，将致病性嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila, Ah）保护性抗原- - S层的基因转化至四膜虫细胞的大核内，与其内具有大量拷贝数的rDNA分子整合后，随四膜虫增殖而复制，并在四膜虫细胞内表达。然后以转化的四膜虫感染鲫鱼，使AhS层蛋白被随之带进鱼体而刺激机体产生免疫应答，从而达到预防嗜水气单胞菌感染的目的。本研究不仅在理论上探讨以寄生虫作载体表达细菌基因的可能性，而且为基因工程疫苗的研制及其在鱼类上的应用探索一条新途径。

结论摘要：

四膜虫是一种非致病性纤毛虫，国外研究表明其可作为一种理想的表达细胞。本课题以嗜热四膜虫组蛋白H4-I基因作为启动子,利用该基因的5′和3′侧翼区作为同源臂,并保留基因编码区起始密码子ATG和终止密码子TGA,中间嵌入巴龙霉素抗性标记基因neo,从而成功构建了基因打靶载体pSK-H4-I-neo。按照四膜虫基因密码子偏好，优化嗜水气单胞菌保护性抗原- - 外膜蛋白A(ompA)基因密码子，并合成一段抗原性较强的基因片断，通过重叠延伸方法，构建neo-linker-ompA融合基因。以此融合基因取代 pSK-H4-I-neo 质粒中的neo，从而构建表达质粒pSK-H4-I-neo-linker-ompA。将其电击转化四膜虫，Western blot分析显示ompA基因在四膜虫体内表达，但免疫荧光染色显示蛋白表达不在虫体表面。鱼体免疫保护试验发现，该转化虫体感染剑尾鱼，不能激发鱼体产生良好的免疫应答，也无法抵抗嗜水气单胞菌强毒菌株攻击。本研究结果具有重要的理论意义，表明以寄生虫作载体表达细菌基因是可行的。但作为重组疫苗的运输载体，应该将外源基因高表达在四膜虫细胞表面，这是课题组正在研究的方向。