中文摘要：

肝脏缺血再灌注损伤已证实与细胞内钙超载、能量代谢障碍、氧自由基损伤和细胞凋亡密切相关，降钙素基因相关多肽(CGRP)兼有防止细胞内钙超载、改善能量代谢障碍、抗氧自由基损伤和细胞凋亡作用，是理想的预防肝脏缺血再灌注损伤的药物。目前的研究发现外源性CGRP抗肝脏缺血再灌注损伤作用显著，但存在CGRP受体饱和缺陷影响受体配体结合效率，我们设计利用HBV的肝靶向性启动子调控CGRP受体表达特异提高受体配体结合效率，通过体外肝窦内皮细胞培养实验、大鼠肝脏离体低温缺血再灌注损伤模型实验和大鼠肝脏在体热缺血再灌注损伤模型实验，观察该目的蛋白对肝脏缺血再灌注损伤时细胞凋亡、氧自由基和钙离子的影响，为更有效地减轻肝脏缺血再灌注损伤的程度甚至彻底防止肝脏缺血再灌注损伤的发生开辟新途径。

结论摘要：

肝脏缺血再灌注损伤（Hepatic ischemia reperfusion injury，HIRI）是肝外科手术尤其是肝移植面临的重大问题，是导致复杂肝切除手术、严重肝创伤手术失败和病人死亡的主要原因；HIRI也是造成移植物原发性无功能的原因之一。然而，当前对HIRI治疗效果仍不能令人满意。降钙素基因相关肽（Calcitonin gene related peptide，CGRP）与降钙素来自同一个基因，广泛分布于人和大鼠等动物的神经和心血管等系统。国外有关CGRP抗缺血再灌注损伤作用的研究已经成为热点，表明CGRP在减轻心脏、肺脏、肾脏等器官的缺血再灌注损伤中扮演着重要角色。我们在前期实验中同样的发现一定范围内外源性CGRP浓度依赖性地减轻肝脏缺血再灌注损伤。由于受体配体存在饱和性，限制了外源性CGRP对肝脏缺血再灌注损伤的保护作用。 我们拟将HBV基因组中Enh1和同时含有Enh2与核心启动子的两个片段连接起来，构建出一个杂合的顺式转录调控元件，再联合上调CGRP受体表达从而靶向放大外源性CGRP的抗肝脏缺血再灌注损伤作用。 本课题组成功构建共表达腺病毒载体AD-CMV-RAMP1-IRES-CRLR及慢病毒载体LV-CALCRL、LV-RAMP1，并对病毒载体的感染功效进行了测定。本课题组成功建立大鼠肝脏缺血再灌注损伤模型及肝细胞缺氧-复氧损伤模型，确定了外源性CGRP对抗肝脏缺血再灌注损伤及肝细胞缺氧-复氧损伤的最佳浓度分别为30ul/body和50nM。同时，本课题组确定了大鼠及肝细胞感染病毒载体的最佳条件。实验结果表明，腺病毒载体AD-CMV-RAMP1-IRES-CRLR及慢病毒载体LV-CALCRL、LV-RAMP1在人源肝细胞系L-02及HepG2中均可明显上调目的蛋白CALCRL及PAMP1的表达。然而，腺病毒载体AD-CMV-RAMP1-IRES-CRLR在大鼠肝脏中及大鼠肝脏细胞BRL-3A中感染效果不佳，考虑由于肝靶向性基因共过表达腺病毒中CRLR及RAMP1基因大， 影响其在大鼠肝脏中的感染效及表达。对HepG2细胞缺氧-复氧损伤模型的研究发现，使用LV-CALCRL、LV-RAMP1上调CGRP受体蛋白表达可明显放大外源性CGRP抗肝脏缺血再灌损伤作用。