中文摘要：

目前发现的机制还不能完全解释肺炎链球菌对氟喹诺酮的耐受，而且缺乏对耐药基因协同关系的研究。本研究采用比较基因组学的方法，结合功能实验全面系统的研究肺炎链球菌对氟喹诺酮的耐药机制。本人所在实验室已经筛选了两株耐氟喹诺酮的菌株并从临床分离到三株耐药菌株。本项目计划以这5株为研究对象，通过比较基因组测序，发现进一步研究的目标，对可能参加耐药机制的基因进行敲除和互补确定其是否参与耐药，发现新的耐药机制；通过对筛选中获得的一系列中间突变体的分析，发现耐药发展的特点；通过在敏感菌株中逐个引入耐药基因（定点突变，互补，插入），在耐药株中逐个敲除基因研究不同耐药基因的相互关系，在耐药形成中起得作用，研究耐药的分子机制；在临床分离的肺炎链球菌耐药菌株库中验证发现的耐药机制，检测它是否存在普遍性，为临床菌株耐药性的监测和控制奠定理论基础。

结论摘要：

我们通过对耐药菌株和敏感菌株的比较基因组分析，发现耐受氟喹诺酮类抗生素的肺炎链菌中，突变集中于靶标DNA促旋酶(四亚基，由gyrA和gyrB基因编码)和拓扑异构酶IV（四亚基，由parC和parE基因编码），所以把研究的重点聚焦于此。在以上四个基因中，已有的报道表明gyrB基因和parE基因的突变不与氟喹诺酮耐药耐药表型相联系，我们的研究中发现了parE和gyrB的突变与其他靶标突变协同作用，导致耐药水平的提高。为了揭示靶位点突变之间的相互关系，我们对耐药进化路径进行了研究，发现氟喹诺酮耐药进化路径中靶位点突变随着筛选压力的增加而逐步增多，三种不同药物在获得相同耐药水平时靶位点的突变数量和种类不一样，这暗示着不同氟喹诺酮耐药发展的快慢存在差异。研究还发现，不同靶位点突变频率在群体中呈现变化的趋势，临床报道的主流突变在进化中最终固定下来，而一些非主流突变（即临床中较少出现）在中期出现而后期消失，没有固定下来。为了探索进化路径形成的原因，进一步构建了30个突变体，结合耐药表型分析，阐明了靶位点突变之间的协同关系，揭示了正向的上位效应（positive epistasis）在氟喹诺酮耐药中所起的作用，同时发现在耐药发展的过程中存在无性干涉（clonal interference）现象，用适应性代价解释了产生这种现象的原因。本研究不仅发现了肺炎链球菌对氟喹诺酮耐药的新机制，而且分析不同靶点突变在氟喹诺酮耐药进化中所起的作用及相互关系，揭示了上位效应在耐药进化中的重要作用，为临床防治氟喹诺酮耐药菌感染和新药研制提供理论依据。此外，通过基因组测序的方法，我们还获得了我国广泛流行的临床耐药肺炎链球菌ST271的全基因组序列。在此基础上，我们分析了携带多种耐药基因的转座子Tn2010的转移方式，并阐明了转移方式对基因组进化的影响。研究期间，共发表文章3篇，SCI文章2篇，一篇文章正在整理中。