中文摘要：

细菌对抗菌药物的耐药问题日趋严重，细菌耐药性已经成为全球关注的一个热点。初步研究结果表明，中药耐药性逆转剂在抗感染治疗中显示了极具吸引力的应用价值和良好前景，但中药逆转细菌耐药性的研究处于起步阶段。本研究选取苦豆子碱作受试药物，考察苦豆子碱对动物源性耐药性大肠杆菌的活性及逆转耐药性分子机制。在分离鉴定大肠杆菌基础上，应用双纸片协同法确证产超光谱β-内酰胺酶（ESBLs）耐药性大肠杆菌菌株；应用分子生物学手段，对菌株的β-内酰胺酶进行分型；检测苦豆子碱对β-内酰胺酶活性影响，扩增β-内酰胺酶编码基因并测序，分析编码基因突变和氨基酸变异特点；确认苦豆子碱对细菌外输蛋白AcrAB蛋白表达产量的影响；分析药物对R质粒消除规律；验证苦豆子碱对青霉素结合蛋白（PBPs）药物作用位点引起的蛋白结构变化特点；系统总结苦豆子碱对耐药性大肠杆菌逆转的分子机制，为中西药联合使用和筛选耐药菌株逆转剂提供理论依据。

结论摘要：

大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药性发展迅速，细菌可以产生多种耐药机制，从而使得β-内酰胺类抗生素对耐药性大肠杆菌感染的治疗变得越来越困难，克拉维酸钾是β-内酰胺酶最好的抑制剂，但大肠杆菌不单纯产生β-内酰胺酶，所以研究中药逆转细菌耐药性机制对临床合理应用药物有重要意义。通过双纸片扩散法筛选出产超光谱β-内酰胺酶动物源性耐药大肠杆菌菌株。测定中药苦豆子碱对分离菌株的抗菌活性，最小抑菌浓度为2.5-15 mg/mL。测定苦豆子碱作用前后ESBLs的活力水平和编码SHV型ESBLs基因的影响，结果表明苦豆子碱对耐药菌株ESBLs活力具有抑制作用，对超光谱β-内酰胺酶蛋白一级结构无影响。筛选出了2株耐环丙沙星、头孢噻肟、阿米卡星和氨苄西林药物的多重耐药性大肠杆菌，对编码外排泵系统中acrA、acrB、acrR、tolC基因进行克隆、测序，同时应用实时定量PCR检测苦豆子碱对多重耐药菌株作用前后外排泵基因的表达量影响。数据分析发现作用前后编码大肠杆菌外排泵系统各基因碱基序列未发生变化，但苦豆子碱作用后外排泵系统中AcrA、AcrB mRNA表达量下降，负调控蛋白AcrR mRNA表达量上升。苦豆子碱从整体上可以抑制耐多药大肠埃希氏菌AcrAB-TolC mRNA表达量，使大肠杆菌多药外排泵AcrAB-TolC mRNA表达量下降，从而恢复大肠杆菌对抗生素的相对敏感性。 PBP3是β-内酰胺类抗生素主要作用靶位点，靶位蛋白的任何改变都能使大肠杆菌对β-内酰胺类抗生素产生耐药。用8mg/mL的苦豆子碱作用于产PBP3耐药菌株36h和48h后，能使菌株对抗生素的敏感性发生变化，MIC值下降了8~16倍；作用后耐药菌株的PBP3 mRNA表达量下调，从而使耐药性大肠杆菌恢复相对敏感性。临床分离菌株耐药种类集中在7~12种抗生素之间，整合酶基因(intI1)检出率为66.7%，基因盒检出率为75%，其中共检测到两种基因盒类型，用苦豆子碱亚抑菌浓度作用于Ⅰ类整合子中携带基因盒的阳性菌株，导致其耐药程度和耐药种类均发生了改变；将药物处理后的基因盒阳性菌株与标准株进行水平培养，发现豆子碱亚抑菌浓度能够减弱耐药性传播的程度，初步表明苦豆子碱在延缓Ⅰ类整合子散播方面发挥了积极作用。