中文摘要：

寄生虫分泌的蛋白酶抑制剂是寄生虫参与与宿主相互作用的重要分子，但目前尚缺少人体寄生线虫kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂（KuI）与宿主相互作用分子及机制研究。本项目前期从主要人体寄生钩虫－十二指肠钩虫中获得了7种KuI（AduKuI），推测他们可能作用于宿主蛋白酶，以利于虫体在宿主体内生存或对宿主致病。本项目拟通过重组制备各AduKuI，分别检测AduKuI对作为丝氨酸蛋白酶的消化酶、凝血相关因子以及部分参与炎症与免疫反应的蛋白酶等的作用，并结合各AduKuI组织分布部位，阐明各AduKuI在十二指肠钩虫适应人体宿主肠道寄生、获取营养、抗炎及免疫反应中的作用；通过测定各AduKuI的三维结构，阐明其与宿主分子相互作用机制。本项目研究可深入了解钩虫与宿主相互作用的机制，并可基于重要AduKuI靶点来研究新的干预措施，为钩虫病的防治提供新的思路，还可能为基于AduKuI活性的药物研究奠定基础。

结论摘要：

丝氨酸蛋白酶抑制剂在寄生虫与宿主相互作用中发挥重要作用,但对人体寄生钩虫中的丝氨酸蛋白酶抑制剂及其与宿主分子的相互作用还了解很少。本项目组在前期首先从主要的人体寄生钩虫－十二指肠钩虫中获得了7 种kunitz 型丝氨酸蛋白酶抑制剂（AduKuI），本项目利用原核表达系统制备了重组AduKuI1~ AduKuI7，用凝血酶原时间及活化部分凝血酶原激酶时间法观察了其抗凝作用，用全血法观察了其抗血小板聚集作用，用发色底物法检测了其对消化酶（人/猪胰蛋白酶、人/牛胰糜蛋白酶及猪胰弹性蛋白酶）、人凝血因子、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)、组织蛋白酶G(CG)、蛋白酶3(PR3)、糜酶、类胰蛋白酶的抑制作用；用SD大鼠棉球肉芽肿模型及心肌缺血再灌注损伤模型、BALB/c小鼠过敏性哮喘模型及急性急性肺损伤模型观察了rAduKuI4的调控炎症作用；用免疫组化法研究了AduKuI1及AduKuI4的组织分布。结果表明rAduKuI1~ 7均无明显抗凝作用及抗血小板聚集作用；rAduKuI1是广谱的丝氨酸蛋白酶抑制剂，对CG、PR3、牛α-胰糜蛋白酶具有很强抑制作用，对NE、人胰糜蛋白酶也有较强抑制能力，对人糜蛋白酶、猪胰蛋白酶有一定抑制活性；rAduKuI4对CG有较强的抑制活性，对人糜蛋白酶及PR3有一定抑制活性；rAduKuI4对实验动物炎症均具有较好抗炎作用，可能参与NF-κB P65的活化及p38 MAPK的激活；AduKuI2/5/6对NE或PR3有较强或一定抑制活性；AduKuI1及AduKuI4均主要分布在成虫的体表、咽腺及肠道组织。前述结果提示AduKuI可能在十二指肠钩虫抵抗宿主消化酶对虫体的酶解，适应肠道寄生中发挥重要作用，同时，还可能通过抑制中性粒细胞分泌的丝氨酸蛋白酶而参与调控宿主的炎症反应，逃避宿主对虫体的免疫效应。此外，除前述7种AduKuIs外，本项目还从十二指肠钩虫及美洲钩虫中分离到20多个新KuI分子，目前已明确部分钩虫KuI抗凝作用，主要作用靶点是fXIa、血浆缓激肽释放酶及fXa，可能在钩虫吸血寄生及引起宿主贫血中发挥重要作用，而此前还无美洲钩虫抗凝分子的研究报道。因此，通过本项目研究，揭示了钩虫KuI在虫体适应宿主肠道寄生、获取营养、抗炎及调控宿主免疫反应中发挥了重要作用，对于深入了解钩虫与宿主的相互作用及其致病机制具有重要科学价值。