中文摘要：

利用弱毒株系防治病毒病是一种非常有效的手段。以前所用的弱毒株系大多只在个别位点有突变。申请者认为，利用现有技术可人工构建含有多个突变的弱毒突变体，不仅能取得良好的防治效果，而且会显著降低其发生回复突变的风险。烟草脉带花叶病毒（TVBMV）是我国烟草上的一种重要病毒，田间发病率逐年上升。我们已经获得TVBMV强毒株系YND的侵染性克隆，测定了弱毒株系HN39的全基因组序列，并证明HC-Pro是影响TVBMV致病力的决定簇。本研究拟首先明确HC-Pro影响TVBMV致病力的氨基酸及分子机制，然后根据上一个基金项目的结果，在影响蚜传和协生的位点引入突变，获得不能蚜传、与其它病毒无协生作用的弱毒突变体，分析其对野生型TVBMV的交叉保护效果及其后代群体发生回复突变的频率。本研究在理论上可深化对TVBMV致病机制的了解，在实践上可为将来利用弱毒株系防治TVBMV提供物质基础和理论指导。

结论摘要：

利用弱毒株系防治病毒病是一种非常有效的手段。但以前所用的弱毒株系大多只在个别位点有突变，这样的突变体有突变为强毒株系的风险。本研究的假设是，利用现有技术可人工构建含有多个突变的弱毒突变体，不仅能取得良好的防治效果，而且会显著降低其发生回复突变的风险。 本项目在获得了烟草脉带花叶病毒（TVBMV）全基因组序列、分析了TVBMV种群遗传结构的基础上，利用自主构建的TVBMV侵染性克隆，分析了了HC-Pro 17个突变 体对TVBMV致病力的影响，发现除了HC-Pro的CDN和FRNK基序影响TVBMV致病力外，首次发现糖基化和IGN等基序也参与调控TVBMV的致病力；分析了这些氨基酸对HC-Pro抑制RNA沉默活性的影响，发现导致HC-Pro抑制RNA沉默活性降低的突变可能使降低病毒的致病力，但导致HC-Pro抑制RNA沉默活性完全丧失的突变一定能降低病毒的致病力；发现R182、D198、IGN等位点和糖基化作用能同时调控协生、抑制RNA沉默及致病力。将这些突变聚合，获得了含有2个或3个位点突变的弱毒突变体，多位点弱毒突变体的致病力进一步下降；将调控蚜传的位点敲除，获得了含有多位点突变、不能蚜传、与PVX无协生作用的弱毒突变体。在间隔期为5-11天时，弱毒突变体能对强毒株系有非常好的的交叉保护效果。间隔期越长，保护效果越好。将弱毒突变体转接20多代，分析其后代的遗传稳定性，证明了突变位点越多，发生回复突变几率越小的假设。 本项目培养博士研究生3人，硕士研究生2人，申请专利3项，在SCI收录的刊物上发表论文7篇。