针对微操作机器人的结构特点和工作环境,提出了一种基于边缘孔径细光束照明原理的纵向定位新方法.即使用两束对称的不同颜色轴外光照明,可以直接从显微图像中得到离焦量和离焦方向.这种方法具有操作简单、计算量小等特点,定位精度达到1μm.本文给出这种方法的理论推导和实验结果.