中文摘要：

鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)引起鸡慢性呼吸道病（CRD）。该病是降低养禽业经济效益的重大疾病。本课题拟运用课题组已获得的重组融合蛋白GST-pMGA1.2为配体，与SPF鸡的气管纤毛细胞裂解液孵育，采用GST pull down、免疫共沉淀及质谱技术等分离鉴定pMGA在鸡气管纤毛细胞上的特异受体。将质谱分析所得的数据在蛋白数据库上进行鉴定，根据所得肽段设计简并引物，采用RT-PCR及RACE技术克隆受体，表达受体及验证受体基因，与鸡全基因组序列比对，获得受体的DNA序列及染色体定位。应用生物信息学分析受体的生物学特性、蛋白结构并进行功能注释，进一步采用RNA干扰、基因突变、二维电泳、免疫组化和动物试验等技术策略，解析受体基因的功能，并评估其理论与应用价值。本项目的完成对阐明MG的致病机理、分子抗病育种、基因工程疫苗及抗MG药物的设计具有重要意义。

结论摘要：

鸡毒支原体(MG)引起鸡慢性呼吸道疾病（CRD），严重降低养禽业经济效益。本课题运用课题组已获得的GST-pMGA1.2为配体，与SPF鸡的气管纤毛细胞裂解液孵育，采用病毒铺覆蛋白免疫印迹技术（VOPBA）、GST pull down技术及质谱技术分离鉴定了pMGA1.2受体为载脂蛋白A-I（ApoA-I）；对ApoA-I进行了克隆表达，通过VOPBA、Dot-ELISA及抗体阻断实验验证pMGA1.2与ApoA-I在体外特异结合，且82-140氨基酸是结合区之一；构建了ApoA-I、pMGA1.2的干涉载体及真核表达载体，通过RNAi及超表达技术，运用流式细胞仪检测ApoA-I与pMGA1.2在细胞水平上存在相互作用；通过激光共聚焦技术确定ApoA-I和pMGA1.2瞬时表达时主要发生在细胞核中，在Hela细胞中能够结合，且没改变其在细胞中的定位；ApoA-I与pMGA1.2极显著地加速了细胞凋亡（p<0.01）；通过超表达或干涉ApoA-I或pMGA1.2发现，MG攻毒后DF1细胞的凋亡率极显著增加（p<0.01），而ApoA-I干涉或超表达均可极显著地降低因MG感染而引起的细胞凋亡率（p<0.01）。结果说明，ApoA-I是pMGA1.2的受体蛋白；pMGA1.2与ApoA-I特异性结合可加速标准细胞系Hela和易感动物体细胞的凋亡，阐明了MG感染的分子机制和细胞病理学特点。 TLR2与TLR6在MG感染中起重要作用。MG感染DF-1细胞后通过TLR6激活NF-κB信号通路，促使各基因表达上调。结果说明，TLR6是MG感染细胞的关键信号基因；TLR2对TLR6有协同作用，但对固有免疫不起关键作用；TNFα是炎性反应的关键因子，在MG感染中TNFα不仅受NF-κB信号通路中的基因调控，还可能存在其它的调控途径。鸡胚在感染MG前期，NF-κB信号通路中各基因调控与细胞中一致，而19d的鸡胚与前期结果相反，推测免疫过程中存在负反馈调节，具体调控机制正在深入研究。本项目的完成对阐明MG的致病机理、分子抗病育种、基因工程疫苗及抗MG药物的设计均具有重要意义。