中文摘要：

临床上发现近半数表现神经症状的肝豆状核变性（WD）患者服用青霉胺后神经症状加重，可能原因是脑结合铜被动员后直接增加脑游离铜，或肝结合铜被动员后增加血游离铜，通过血脑屏障进入脑。我们前期动物实验发现给予青霉胺后，基底节和脉络丛铜转运蛋白ATP7A表达明显增高 ，提示药物驱铜后脑细胞内游离铜升高，脉络丛排铜进入脑脊液。脑细胞内增多的铜是从何而来？是蛋白结合铜释放还是从外周经血脑屏障进入？是不是产生氧化应激导致神经毒性？如何防治？本研究拟以TX小鼠喂食青霉胺后微透析在体获取脑组织间液和血透析液后检测其铜浓度动态变化，检测铜转运蛋白在血脑屏障和脑内的表达和定位，超滤法分离获得蛋白结合铜量和非蛋白结合铜量，进一步确认驱铜后脑游离铜变化 及阐明其来源，以及是否带来氧化应激损害，并探讨驱铜时联用抗氧化剂对神经细胞的保护作用。

结论摘要：

背景脑型肝豆状核变性（WD）患者青霉胺驱铜后神经症状加重是WD治疗的一大难题，我们前期实验发现给予TX小鼠（WD模型鼠）青霉胺后，基底节和脉络丛铜转运蛋白ATP7A表达明显增高，脑组织内游离铜升高。有待探讨的问题脑组织内增多的铜是蛋白结合铜释放还是从外周经血脑屏障进入？驱铜治疗后如何导致神经毒性产生？内容1. 以TX小鼠喂食青霉胺，微透析在体内获取脑基底节细胞间液后，透析液分别采用电感耦合等离子质谱法（ICP-MS）和高效液相结合对苯二甲酸捕获法测定游离铜离子及羟自由基浓度及其动态变化。2. 检测铜转运蛋白在血脑屏障和脑内的定位和表达。3. 超滤法分离获得蛋白结合铜量和非蛋白结合铜量，确认青霉胺对TX小鼠基底节细胞间液游离铜浓度的影响。 4.检测青霉胺驱铜后TX小鼠血脑屏障功能，脑细胞形态以及线粒体的形态和功能。结果1. 铜转运蛋白(CTR1、ATP7A、ATP7B)表达具有时间、组织、脑内部位和细胞特异性，提示其表达变化与各组织执行的功能相关。当ATP7B基因发生突变时，ATP7B蛋白在神经细胞中的定位发生改变，主要在细胞核中表达。2. 青霉胺可导致TX小鼠肝、脑总铜含量降低，血清铜、肾脏组织、基底节细胞外液中游离铜升高。提示青霉胺可以有效驱除肝脏、脑组织中蓄积的铜；但治疗早期可引起基底节细胞外液游离铜升高，这部分升高的游离铜主要来自脑内蓄积铜的动员。3. 青霉胺驱铜早期基底节游离铜和羟自由基浓度显著升高，而四硫钼酸铵（一种不会引起WD患者神经症状加重的驱铜药）驱铜不引起纹状体游离铜及羟自由基浓度的升高，因此，游离铜离子和羟自由基水平的不同可能是青霉胺和四硫钼酸铵出现不同临床结局的原因。 3.基底节细胞外液游离铜浓度升高及其导致的羟自由基生成增加，可能是青霉胺驱铜导致神经毒性的原因。 4.青霉胺驱铜可引起TX小鼠血脑屏障破坏，基底节细胞髓鞘结构疏松，线粒体结构和功能改变。 5.体外培养神经细胞，低浓度的青霉胺单独存在时无神经细胞毒性，当和铜离子共存发生络合作用时可导致ROS产生增加，引起线粒体膜电位降低，神经细胞活力下降。 意义青霉胺驱铜过程中引起的脑细胞外液游离铜浓度增加和羟自由基水平升高，可能是青霉胺驱铜诱导神经毒性的重要原因。对脑型WD患者，青霉胺的治疗宜从小剂量开始，一旦神经症状加重，即停药或减量。可联合抗氧化和脑保护治疗。