中文摘要：

MiRNA通过在转录后水平负调控靶基因的表达而参与多种生理和病理过程，同时miRNA还在调节病毒复制的过程中起着重要作用。本项目前期研究表明miR-101通过靶定宿主细胞ATP合成酶beta链（ATP5B）抑制HSV-1的增殖。HSV-1感染HeLa细胞后，内源miR-101-2表达水平逐渐增高，而ATP5B表达降低。为了阐明HSV-1感染诱导miR-101-2表达增强的上游分子调控机制，本项目拟通过荧光报告载体技术克隆miR-101-2的核心启动子，用5'RACE实验确定转录起始位点，并通过转录因子功能分析确定参与调控miR-101-2表达的细胞和病毒蛋白，以及它们之间的协同作用。此外，染色质免疫共沉淀和凝胶电泳迁移实验用来验证转录因子与启动子DNA的结合。MiR-101作为一种新发现的HSV-1增殖抑制因子，确定其上游分子调控机制将为研究miRNA抗病毒作用提供理论基础和实验依据。

结论摘要：

近年来的多项研究表明，miRNA不仅参与正常细胞功能的调控，也在病毒与宿主之间以及病毒复制等方面发挥着重要的作用。我们实验室的前期工作表明，用HSV-1感染HeLa细胞后，宿主miR-101升高并通过靶定ATP5B调控病毒的复制。但是病毒是通过什么机制使miR-101表达升高的，miR-101除了靶定ATP5B，还有没有其他的途径可以调控病毒复制，这些正是本课题所研究的主题。 我们发现用HSV-1感染HeLa细胞后，miR-101及其前体pre-miR-101-1， pre-miR-101-2的RNA水平都升高，其中miR-101及pre-miR-101-2升高尤为明显，而且pre-miR-101-2所在基因RCL1升高也比较显著。随后我们构建了pre-miR-101-2的启动子，发现p1060，p973，p657， p570，p421和p334都有启动子活性，且在转染启动子外片4h，8h，12h和HSV-1感染8h后启动子活性都是降低的。靶基因筛选结果表明，GRSF1和COX2是miR-101的候选靶基因，它们的3’非翻译区包含miR-101的潜在结合位点。荧光报告载体实验证实，miR-101能够通过作用于GRSF1和COX2基因的3’非翻译区分别对其表达进行正性和负性调节。而在miR-101过表达的HeLa细胞中，GRSF1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显升高，COX2基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显降低。在miR-101封闭的HeLa细胞中，GRSF1基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显下降，COX2基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平都有明显升高。HSV-1感染HeLa细胞后，miR-101的表达水平升高，同时miR-101表达水平的改变是源于其前体pre-miR-101-2，而HSV-1对pre-miR-101-2的启动子有抑制作用。在HeLa细胞中miR-101通过对其靶基因GRSF1和COX2的正性和负性调节影响病毒的复制。通过阐明病毒对miR-101以及miR-101对病毒复制的作用机制有助于我们进一步理解病毒和宿主之间的相互作用，同时也为病毒感染的诊断和治疗提供新依据。