中文摘要：

失神经喉肌纤维化导致神经修复后喉肌功能恢复不佳是临床声带麻痹治疗的难点问题。申请人已证实失神经喉肌中miR-21上调和TGFβ1/Smad3信号通路激活，与纤维化程度密切相关；文献证实Smad7和STAT3负性调控TGFβ1/Smad3信号通路，促进肝肾等组织纤维化；我们采用生物信息学方法，发现Smad7和STAT3可能是miR-21下游靶分子。推测miR-21 在转录后水平调控Smad7和STAT3表达，调节TGFβ1/Smad3促失神经喉肌纤维化。为此，本课题利用Smad3基因敲除小鼠和人失神经喉肌标本，通过荧光素酶报告、功能获得与缺失等实验，从分子、细胞、组织和体内实验等方面研究，阐明miR-21调控TGFβ1/Smad3信号通路对失神经喉肌纤维化的作用及确切机制。从microRNA角度揭示失神经喉肌纤维化的病理机制，为延缓或减轻失神经喉肌等骨骼肌纤维化，提供新的治疗策略和理论依据。

结论摘要：

失神经喉肌纤维化导致神经修复后喉肌功能恢复不佳是临床声带麻痹治疗的难点问题。失神经喉肌中miR-21上调和TGFβ1/Smad3信号通路激活，与纤维化进程密切相关。我们利用生物信息学技术和荧光素报告基因实验，证实SMAD7、TGFβR2是miR-21直接靶基因，IL-12A和AGO4也是miR-21的靶基因。我们又发现miR-21上游存在转录因子NFκB的结合位点，分别用TNFA促进NFκB核转录，用PDTC和SN50抑制NFκB核转录，miR-21的表达水平随之变化，提示NFκB可能是miR-21的上游调控子。我们构建了miR-21抑制载体pLKO-Anti-miR-21，体内试验证实可有效下调miR-21表达水平。离体实验以TGFβ1处理激活成纤维细胞，并成功转染Anti-miR-21，采用定量PCR、免疫荧光等技术，检测miR-21的干扰效果及SMAD7、p-SMAD2/3、α-SMA的表达。结果显示抑制miR-21可显著上调SMAD7，而p-SMAD2/3下调，下游纤维化指标如α-SMA表达下降。流式细胞检测结果显示转染miR-21后Smad7的荧光强度下降、核转位能力下降，p-smad2/3的荧光强度上升、核转位能力上升；转染Anti-miR-21后Smad7荧光强度上升，p-smad2/3荧光强度下降。由此证明，miR-21在激活的成纤维细胞中能直接抑制Smad7分子，进而促进p-smad2/3复合体的形成及转核，促进下游纤维化因子的合成及分泌。在体实验中，我们构建了坐骨神经损伤的动物模型，注射miR-21抑制剂pLKO-Anti-miR-21，利用原位杂交、免疫荧光、定量PCR等技术，检测miR-21、SMAD7、TGFβ1，以及纤维化相关分子CTGF、α-SMA和collagen的表达水平。结果显示抑制miR-21的表达后，可上调小鼠失神经肌肉损伤模型中组织中的SMAD7的表达，并下调TGFβ1、CTGF、α-SMA和collagen等纤维化因子的表达，提示抑制miR-21可延缓或改善失神经肌肉纤维化的进程。本项目较系统地阐明了miR-21在失神经支配喉肌纤维化进程的作用和调控机制，为促进失神经骨骼肌的结构重建和功能恢复提供了有潜力的治疗策略。