中文摘要：

海参具有很强的自溶能力，在受到外界的理化及生物因素刺激后，体壁会出现"溶解、化皮"现象，造成经济损失。只有揭示海参体壁自溶机理，才能找到有效控制自溶的方法。海参体壁的自溶过程是以内源性蛋白水解酶为主的自溶酶对海参体壁的水解破坏过程，这使得自溶酶研究成为自溶机理研究的核心内容。然而，如何鉴定海参自溶酶，海参自溶酶的来源与释放方式怎样，目前仍是困扰自溶酶研究的难点问题。本项目拟采用免疫电镜技术，研究自溶前后及自溶不同阶段海参体壁的超微结构变化以及蛋白水解酶的组织分布变化，以此来鉴定海参自溶酶并揭示其来源与释放方式。具体策略如下首先，通过半制备高效液相色谱制备高纯度海参体壁蛋白水解酶，并以之为抗原制备相应的单克隆抗体；接着，利用所获单克隆抗体对自溶前后及自溶不同阶段的海参体壁组织切片进行免疫组化染色；最后，通过透射电镜观察经免疫组化染色的海参体壁组织切片以鉴定海参自溶酶并揭示其来源与释放方式。

结论摘要：

海参具有很强的自溶能力，受到外界的理化及生物因素刺激后，体壁会出现“溶解、化皮”现象，造成经济损失。只有揭示海参自溶机理，才能找到有效控制自溶的方法。本项目制备海参组织蛋白酶，并以之为抗原制备抗体。利用组织化学技术对自溶前后海参体壁组织中的目标酶进行染色定位。通过光学显微镜及透射电子显微镜观察海参体壁的微观结构变化以及酶的分布变化，鉴定海参自溶酶，揭示其来源与释放过程。项目组完成预定研究目标，研究内容发表SCI收录英文论文4篇，核心期刊中文论文1篇，并获得中国发明专利一项。采用半制备高效液相色谱匹配高分离度分离介质制备了海参肠组织蛋白酶L、B纯酶，研究了酶的分子量、最适pH值、最适温度、温度稳定性、金属离子对酶活性的影响、抑制剂及激活剂对酶活性的影响及底物特异性等酶学性质。以纯化酶为抗原制备抗体用于免疫组化研究。海参体壁组织切片经苏木精-伊红（HE）染色，光镜下的观察结果显示，海参体壁自外而内依次为角质层、上皮层、真皮层及体腔衬里上皮组织，真皮层根据胶原结缔组织的致密程度从外向内分为疏松层和致密层。自溶后，角质层逐渐破损，甚至消失；上皮细胞排列变的混乱；疏松结缔组织纤维网络状结构变得稀薄；致密结缔组织纤维网络状结构逐渐变得模糊。总体上，致密结缔组织自溶现象不如上皮及疏松结缔组织明显。免疫组织化学法研究结果表明，组织蛋白酶L在海参体壁中的分布具有不均一性，上皮及疏松结缔组织中酶分布比较密集，致密结缔组织中酶分布相对稀疏。酶组织化学法研究结果表明，组织蛋白酶L酶活性位点在海参体壁中的分布特点与免疫组织化学法实验结果一致。随着自溶的进行，海参上皮、疏松结缔组织及致密结缔组织中的酶活性位点均显示出由集中变为分散甚至消失的规律，这可能是酶释放出所在细胞器或细胞，在组织中扩散，导致局部酶浓度降低造成的。采用透射电镜-酶组织化学法研究了组织蛋白酶L在海参体壁细胞中的分布。结果表明，海参细胞中含有多个形状不规则的囊泡状细胞器，组织蛋白酶L染色颗粒就附着在这些囊状细胞器的外膜内侧。随着自溶的进行，囊状细胞器中的酶染色点逐渐减少甚至消失，这表明组织蛋白酶L从囊状细胞器中释放。综上所述，海参体壁组织中的组织蛋白酶L分布越密集，组织自溶现象越明显，二者之间出现了正向的相关性，说明组织蛋白酶L与海参自溶相关。自溶前，该酶存在于体壁细胞的细胞器中，自溶过程中释出细胞器，参与组织降解。