中文摘要：

随着工业技术的快速发展，水源和土壤的重金属污染问题日益严重，严重危害人类的生殖健康，而目前对重金属雄性生殖毒性的分子机制尚未明确，也缺乏特异性的毒性标记物。本研究拟选用汞、镉、锰和铅作为受试物，观察比较不同剂量、不同作用时间，重金属对共培养体系中睾丸leydig细胞形态和功能的影响；检测线粒体结构和跨膜电位；采用基因芯片和SILAC标记的LTQ Orbitrap蛋白组学技术，在基因和蛋白水平上筛选线粒体的差异表达基因和蛋白；建立信号网络，总结归纳出不同重金属暴露下，与睾丸leydig细胞损伤相关的、有意义的信号分子；最后再回到动物体内，通过免疫组化和原位杂交的方法进行验证。本研究以线粒体作为靶点，拟通过探讨重金属暴露对睾丸leydig细胞的毒性作用分子机制，为临床男性性功能低下的治疗提供实验依据，同时也为雄性生殖毒性体外替代实验模型的建立及评价标记提供重要的借鉴。

结论摘要：

随着工业技术的快速发展，水源和土壤的重金属污染日益严重，严重危害人类的生殖健康。目前对重金属雄性生殖毒性的分子机制尚未明确，也缺乏特异性的毒性标记物。本研究以线粒体为靶点，采用蛋白质组学技术结合siRNA技术，就镉、锰和铅对睾丸间质细胞的毒性作用及其机制进行了深入的探讨。研究取得了较为创新的实验结果，为临床男性性功能低下的治疗提供实验依据，同时也为雄性生殖毒性体外评价替代模型的建立提供重要的借鉴。研究内容包括两部分一是线粒体内蛋白二氢硫辛酰胺脱氢酶（Dihydrolipoyl dehydrogenase, DLD）在重金属（镉、锰、铅）对Leydig细胞毒性机制中的研究；二是线粒体作为靶细胞器在醋酸铅对Leydig细胞毒性作用中的研究。应用蛋白质组学技术，在镉暴露的睾丸间质细胞中鉴定出32个差异表达蛋白，有13个为线粒体相关蛋白。在差异表达蛋白相互作用通路中，DLD位于通路的中心，与睾酮的合成通路相关。R2C细胞中DLD表达随着镉浓度的增加，在蛋白和基因水平上均呈现为显著下调。作为DLD的下游信号分子，细胞内cAMP水平也随着镉浓度的增加而显著下降。跟镉一样，锰和铅都能抑制Leydig细胞合成孕酮的功能，并且都能显著下调DLD的蛋白表达水平。为了证实DLD与重金属抑制类固醇激素分泌毒性作用机制的相关性，我们采用siRNA技术干涉DLD的基因表达。结果显示，DLD的基因表达沉默与重金属镉、锰和铅对R2C细胞的毒性作用一样，都可以显著抑制类固醇激素合成酶StAR，CYP11A1和3？HSD的蛋白表达水平，从而抑制孕酮的生成。体内实验部分，重金属暴露的大鼠睾丸组织同样验证了DLD的低表达水平。类固醇激素的合成依赖于线粒体内MEK1/2和ERK1/2的活化，而两者的磷酸化由线粒体内的PKA所激活。在重金属铅对睾丸间质细胞毒理作用的研究中发现，其毒性作用与线粒体密切相关。铅促使睾丸间质细胞内cAMP水平下降，cAMP的下降同时抑制线粒体内PKA蛋白的表达，从而抑制线粒体内MEK1/2和ERK1/2的磷酸化，进而影响StAR的活化，抑制孕酮的合成和分泌。扫描电镜结果还发现，铅能够抑制线粒体的融合，而线粒体的融合与激素分泌密切相关。据此我们采用siRNA技术干涉线粒体融合蛋白Mfn-2的基因表达。结果显示，该基因的表达沉默抑制类固醇激素合成酶StAR蛋白的表达和孕酮的生成。