中文摘要：

4-香豆酸:辅酶A连接酶（4CL）是木质素生物合成过成中的关键限速酶，抑制其活性可能会对木质素含量及组分产生重要影响。而象草是热带亚热带地区重要的种质资源，可用作牧草、能源作物和造纸原料，其品质的好坏与木质素含量密切相关。本项目拟以华南象草和摩特矮象草为研究材料，对4CL基因进行克隆和生物信息学分析，同时采用RNA干涉技术沉默4CL基因的表达，并通过对转基因植株木质素和纤维素含量测定及4CL酶活性检测，来分析4CL基因的功能。其研究结果不仅可以丰富和发展木质素生物合成的分子机理，拓展象草分子生物学的研究基础，而且还可以为象草饲用、造纸用、燃烧发电用、乙醇生产或沼气发酵用品种的选育提供理论指导。

结论摘要：

项目完成了计划内4项研究内容，完成了7项预期成果中的6项，发表论文8篇，并取得如下研究成果1）利用RT-PCR和RACE技术，得到了Mott和Huanan象草4CL的cDNA序列（GU997597和JN980970）及Huanan象草的gDNA序列（JQ219852）。2）在核苷酸水平上，象草4CL基因与玉米、柳枝稷、黑麦草（4CL3）的相似性超过了88%。3）在蛋白质水平上构建了象草4CL酶的一至三级结构，其中二级结构中有大量无规卷曲和α-螺旋。这些结构特征决定了蛋白质的3个跨膜结构域和1个疏水区域；同时在一级结构中含有54.53%的疏水性氨基酸。功能位点预测中的5个N端酰基化位点证明了4CL在木质素合成的酰基化作用。4）核苷酸系统进化树明确地将现有记录的被子植物4CL基因分为单子叶和双子叶两大类群，说明4CL基因进化与植物的进化过程具有极其密切的关系。而在4CL氨基酸序列构建的系统进化树中，单子叶植物香荚兰、水稻（4CL2）、黑麦草（4CL1）在进化中出现在双子叶植物类群中。这一现象可能说明4CL基因在植物中的分化超前于形态特征的分化。5）利用Gateway技术构建了RNAi表达载体pCB2004B-4CL，通过冻融法将其转入到根癌农杆菌EHA105中，为进一步研究4CL基因的功能奠定了基础。6）以心叶为外植体，其愈伤组织的诱导和继代采用相同培养基，即MS+2,4-D 0.5mg/L + 6-BA 0.5mg/L +NAA 1mg/L+蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 8.0 g/L；胚性愈伤组织的分化，以MS + NAA 0.5 mg/L+6-BA 2mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉 8.0 g/L + 5%椰乳的效果最好；生根培养，以1/2MS为基本培养基，不加激素；在移栽过程中，华南象草无菌苗易成活，成活率可达100%。7）在已知4CL基因DNA序列的基础上，通过Tail-PCR技术，得到一个约1.6 kb的4CL基因启动子片段，该启动子具有TATA-box、G-box、CAAT-box、ABRE等启动子的基本元件，也具有MYB转录因子结合的位点和一些逆境响应元件。8）构建了pCAMBIA1305.1启动子表达载体，将载体转入EHA105农杆菌中，通过叶盘法转化烟草，成功转化的烟草叶盘能在含有潮霉素的培养基上分化生长。