中文摘要：

组蛋白甲基化修饰在以染色质为模板的基因转录、DNA损伤修复等细胞生物学活动中起极其重要作用，肽精氨酸转亚胺基酶Ⅳ（PADI4）催化精氨酸变成瓜氨酸时发挥了去甲基化作用，是介导组蛋白去甲基化的关键酶。在类风湿关节炎（RA）体内存在PADI4异常高表达，但PADI4对组蛋白甲基化/去甲基化信号通路的影响以及由此造成的滑膜细胞生物学行为改变尚未知。本课题在前期研究基础上，从临床RA患者关节滑膜中鉴定PADI4作用的组蛋白靶分子，利用PADI4表达载体、PADI4 siRNA干扰、特异性抑制剂等分别作用RA关节滑膜成纤维细胞（FLS）及鼠RA诱导模型，验证靶分子并筛选高瓜氨酸化组蛋白的主要效应分子，观察上调或下调PADI4表达对鼠关节滑膜和RA-FLS中包括效应分子在内的促细胞凋亡、促血管新生因子表达影响，以及FLS增殖、凋亡状况变化，以期阐明抑制PADI4对RA关节损伤的防治作用及其作用机制。

结论摘要：

研究发现RA患者血清中特异性抗瓜氨酸化蛋白抗体与RA病情严重程度、关节软骨侵蚀相关，并且关节滑膜组织中存在PADI4异常高表达及大量瓜氨酸化蛋白沉积，表明蛋白瓜氨酸化可能是RA发生、发展的重要分子机制。本项目以RA关节滑膜成纤维细胞（RA-FLS）为主要研究对象，探讨RA-FLS细胞内、外蛋白异常瓜氨酸化对FLS增生、凋亡的影响。主要完成了以下研究内容 1）研究瓜氨酸化波形蛋白(cVim)诱导RA及正常人外周血PBMCs来源的未成熟树突细胞（imDCs）成熟分化及分泌炎症因子的能力。研究首次发现cVim能够诱导正常人及RA患者外周血来源的imDCs成熟、促进分泌炎症因子、增强T淋巴细胞免疫反应。 2）分析瓜氨酸化纤维连接蛋白（cFn）和 cVim对分离培养的RA-FLSs、OA-FLSs细胞增生、凋亡及分泌炎症因子的影响。免疫组化和荧光双标记技术发现与OA相比，RA关节滑膜组织中存在大量瓜氨酸化蛋白沉积，其中cFn为特异性沉积的瓜氨酸化蛋白；cVim能有效地促进RA-FLSs增殖、促进PADI4、RANKL和TNF-α、IL-1等在RA发病机制中起重要作用的炎症因子表达；发现 cFn能显著抑制RA、OA来源的FLSs细胞凋亡、促进TNF-α和IL-1表达。上述发现揭示了RA关节滑膜局部瓜氨酸化蛋白异常沉积是关节滑膜慢性炎症、异常增生的直接诱因。 3）采用PADI4 表达载体及siRNA技术干扰FLS细胞内PADI4表达，观察FLS增生、凋亡表化及可能的分子机制。研究发现， siRNA抑制PADI4表达后RA-FLS凋亡显著增加伴随细胞p53、p21表达增加，同时瓜氨酸化组蛋白H3（cit-H3）也减少、甲基化H3增多；将PADI4表达载体转入RA-FLS，则出现与上述相反情况，细胞凋亡减少，p53、p21表达受抑制，瓜氨酸化组蛋白H3（cit-H3）显著增多。从细胞水平证实了PADI4通过组蛋白甲基化/瓜氨酸化修饰途径调节p53、P21等因子表达来调控FLS细胞凋亡。 4）采用蛋白质谱技术筛选、鉴定了RA-FLS、OA-FLSs差异表达蛋白，并鉴定出三个与 RA-FLSs生存/凋亡失平衡相关的关键分子，人异天冬氨酰甲基转移酶（PIMT）、硫氧还蛋白1（Pirin）和TRX-1表达异常； 5）研制具有自主知识产权的抗环状瓜氨酸短肽（CCP）抗体ELISA检测试剂，并