中文摘要：

前期我们利用基因敲除技术发现Nestin与胚胎血管形成密切相关，最近我们又观察到Nestin表达于肿瘤组织新生血管内皮细胞和体外培养的视网膜微血管内皮细胞(RMEC)，且其表达可被VEGF上调。Nestin作为中间纤维蛋白参与构成细胞骨架，后者介导内皮细胞迁移和血管新生。我们以往研究证实VEGF是目前所知内皮细胞迁移和血管新生的最主要调节因子。由此，我们分析在RMEC细胞VEGF可能通过上调Nestin表达并改变细胞骨架和细胞运动能力从而促进眼视网膜血管新生。本课题拟以氧诱导视网膜血管新生模型和RMEC细胞为研究对象，采用基因敲除、体内外实验、EMSA等方法，旨在获得Nestin促进视网膜血管新生的可靠证据，阐述Nestin对RMEC细胞运动能力的影响及作用模式，证明VEGF能上调内皮细胞Nestin表达并深入探讨其分子机制。本项目将为阐明Nestin参与视网膜血管新生提供充分的科学依据。

结论摘要：

Nestin是新近发现的细胞骨架蛋白，在神经系统分化和发育中发挥重要作用。最近研究表明，Nestin在低分化或增殖状态的血管内皮细胞或祖细胞高表达，提示其可能与血管新生有关，但机制尚不清楚。VEGF是血管生成调控的关键分子，不仅参与胚胎发育，也参与肿瘤、眼内血管新生等病理性血管形成过程。血管新生和成熟是个高度复杂的协调过程，需要一系列配体激活受体的连锁反应，而在此过程中VEGF信号传导通常是其关键的限速步骤。已知VEGF通过调控血管内皮细胞增殖、运动和迁移促进血管形成。细胞骨架及其结合蛋白是内皮细胞运动和迁移的内在物质基础，目前尚未证明VEGF是否能够调节细胞骨架或相关蛋白以促进血管内皮细胞的运动与迁移。前期，我们采用Nestin基因敲除小鼠模型初步证实了Nestin与胚胎血管发生和发育的相关性。本研究中，我们在体外培养的血管内皮细胞上证实VEGF能上调Nestin表达，观察了低氧处理对Nestin表达的调控作用，并采用VEGFR拮抗剂反证这种调控关系的存在；设计和构建Nestin－ 血管内皮细胞亚系，观察到Nestin基因沉默抑制了血管内皮细胞运动能力，并证实Nestin介导了VEGF对血管内皮细胞的促进作用；在氧诱导大鼠视网膜血管新生模型和碱烧伤诱导大鼠角膜血管新生模型分析VEGF与Nestin的表达特点及在血管新生中的相关性；采用细胞划痕实验、体外血管形成实验及显微活细胞培养系统等方法分析VEGF调控Nestin表达改变内皮细胞运动能和血管形成；用FITC-鬼笔环肽标记F-actin和细胞骨架，分析了VEGF及Nestin对血管内皮细胞骨架的改变；在分子机制上，我们初步证实，VEGF对Nestin表达的诱导作用可能与p-ERK MAPK途径有关，并进一步采用RNA-seq通量筛选VEGF处理后转录组变化，并采用Q-PCR验证相关转录因子可能参与VEGF对Nestin的调控。 本项目的研究能够初步明确Nestin调控血管新生的作用及其可能的分子机制，揭示其可能是VEGF介导的血管新生过程中特异性效应分子，是研发具有安全性和有效性的抗血管形成药物的潜在靶点。