中文摘要：

甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）是一类可水解有机磷农药磷酯键从而使其脱毒的酶。其中，来源于苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)的MPH-Och与同类酶相比对甲基对硫磷具有很强的催化能力。然而，研究发现该酶耐热性较差，十分不利于其广泛应用。因此，本研究以稳定酶蛋白结构为目的，从增加蛋白构象稳定性，提高其解折叠自由能和优化蛋白表面电荷分布三方面入手，先通过计算机模拟分析，选取酶蛋白中可能与热稳定性相关的氨基酸，再利用定点突变、组合活性位点饱和突变实验（CAST）等技术进行突变研究，揭示关键氨基酸和结构特性是如何影响MPH-Och的热稳定性，进而获得高效耐热的甲基对硫磷水解酶，为通过理性设计改善蛋白质热稳定性的研究提供新思路。

结论摘要：

甲基对硫磷水解酶（Methyl parathion hydrolase，MPH）是一类可水解有机磷农药磷酯键从而使其脱毒的酶。其中，来源于苍白杆菌(Ochrobactrum sp.)的MPH-Och与同类酶相比对甲基对硫磷具有很强的催化能力，但是其热稳定性较差。本研究采用多种理性设计策略进行突变研究，通过提高解折叠自由能提高，筛选获得了一个最优的四点突变体MPH4 (274-183-197-192)，该酶的Tm值较野生酶高了11.7°C，T50较生酶提高了10.2°C。随后，在四点突变体的基础上，组合入之前研究发现的稳定蛋白质构象的突变位点G194P和离子键突变位点P76D/P78K，最终获得一个七点突变体（S274Q/T183E /K197L/S192M/G194P/ P76D/P78K），其T50较四点突变酶又提高了5°C。热稳定性改良突变酶的获得证实了这些提高热稳定性的方法是有效地，并且其作用具有加合性，这为分子设计改良酶蛋白热稳定性提供了新的研究思路。此外，研究时发现热稳定性改良的突变体MPH-S274Q在毕赤酵母表达系统中分泌效率获得了很大提高，为揭示蛋白质热稳定性与蛋白的分泌表达之间的关系奠定了基础。