中文摘要：

肿瘤微环境介导的耐药是当前国内外学者研究的热点。新近发现多种细胞膜表面蛋白Eph及其配体Ephrin是介导肿瘤细胞与其微环境"crosstalk"的关键分子之一，与微环境介导的耐药密切相关。本课题组前期研究表明在耐药的髓系白血病中均存在粘附通路相关蛋白EphB4、Crkl、RhoA的异常表达，但其具体调控机制不详。本研究中，我们拟应用荧光实时定量PCR、Western Blot进一步检测髓系白血病患者EphB4、Crkl、RhoA、cdc42、rac1表达和活化关系，探讨其与髓系白血病耐药的相关性；并首次在细胞和动物体内，通过RNA干扰和转基因技术调变EphB4表达水平，分析其对柔红霉素耐受性、下游通路Crkl及Rho家族表达、髓系白血病生物学行为的影响，明确EphB4/Crkl/Rho信号通路是调控髓系白血病耐药的重要机制，探求肿瘤微环境介导耐药的早期诊断指标及治疗靶点。

结论摘要：

本课题组首次通过临床标本验证了EphB4在耐药急性髓系白血病患者中表达较高,且在慢性粒细胞白血病对伊马替尼耐药的骨髓原代细胞中的表达较敏感细胞中的升高.细胞水平, 耐药髓系白血病细胞株中EphB4的表达较高,敲除K562-R细胞中EphB4后，K562-R细胞对于IM的敏感性部分恢复，并发现EphB4可介导细胞骨架蛋白Rac1/Cdc42/RhoA的表达，促进K562-R细胞侵袭性增加。我们进一步应用基因芯片技术及生物信息学方法发现EphB4可引起多基因、多条信号通路的改变，涉及细胞凋亡、粘附、增殖、代谢等多个生物学过程以及黏着斑粘附、细胞骨架调节、癌症等多条信号通路,并可通过其III型纤维粘连蛋白结构域及PDZ结合区而非酪氨酸激酶结构域与EGFR和VEGF信号通路的关键分子相互作用，促进血管新生，进而形成耐药保护，此外，可能通过EphB4/MYPT1/VAV1通路增强细胞增殖促进白血病细胞耐药。 我们干扰EphB4表达,发现K562-R-EphB4-sh细胞，对IM敏感性得到明显恢复。在动物体内，K562-R-EphB4-sh移植瘤裸鼠，接受IM治疗后其疗效明显好于K562-R移植瘤裸鼠。我们首次认定EphB4过表达是IM耐药性产生的重要因子。进一步探讨机制发现，MEK？ERK通路蛋白活性并没有随着EphB4表达下调而出现变化。在K562-R-EphB4-sh 细胞株和移植瘤组织中，RhoA和Rac1+Cdc42磷酸化表达水平同步下降。我们首次发现在EphB4过表达介导的Rac1/Cdc42/RhoA通路可能是CML对伊马替尼耐药的机制之一。 我们进一步研究发现高三尖杉酯碱(HHT)联合IM的治疗方案能够显著缩小K562-R移植瘤体积，增加裸鼠生存数目。而HHT干预K562-R细胞及其移植瘤组织后，EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA通路磷酸化活性较前显著下降，HHT具有阻断IM耐药途径EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA的作用，而阿霉素对该通路活性水平则没有影响。我们首次验证了HHT治疗进展/耐药CML的机制可能与抑制EphB4/Rac1/Cdc42/RhoA通路有关。