中文摘要：

血友病B是一种缺乏凝血因子IX（FIX）引起的遗传性出血疾病。本项目拟通过慢病毒介导的基因治疗方法，使FIX基因在血小板特异的αIIb启动子的驱动下表达并储存在血小板中。当发生出血时，血小板在出血部位被激活，储存的FIX将被释放出来在出血部位参与凝血反应促进止血。在正常血小板中并不存在FIX，这一策略可以增加FIX在受损伤部位的局部浓度，更有利于促进止血。同时储存在血小板中可以延长FIX在血液中的寿命，有利于增加FIX的凝血功效。前期的研究已经证明这一策略的可行性，在本项目中，申请者将以血友病B小鼠模型为对象研究确定1.血小板储存的FIX是否能够长期稳定存在并具备活性；2.探索通过体内药物筛选的方法进一步提高FIX的表达水平；3.确定FIX是否能在人的血小板α颗粒中储存并发挥功能。本项目的完成将进一步确定血小板FIX的功效和这一方法可行性，为日后继续进一步的研究和应用提供科学依据。

结论摘要：

本项目研究了靶向血小板的血友病基因治疗方法。通过在血小板异位表达凝血因子IX（FIX）使FIX储存在血小板中参与凝血过程，这可以提高FIX的局部浓度利于止血，也可发展成为针对产生中和抗体患者的治疗方法。研究以ex vivo的方法将2bF9基因修饰的造血干细胞移植进入血友病B小鼠体内，可在小鼠体内产生储存FIX的血小板。F9:Ag和F9:C的测定表明FIX可在血小板中长期稳定表达；激光共聚焦分析显示FIX与VWF共定位于血小板α颗粒中；截尾生存试验证明血小板FIX具有促凝血活性可使移植后小鼠恢复凝血功能；我们的研究结果证明了该治疗方法的长期有效性和可行性。此外我们还研究了进一步增强治疗效果的方法，通过共表达MGMT（P140K）基因结合O6BG和BCNU的药物筛选可以提高2bF9基因修饰的造血干细胞的比例，从而增加表达FIX的血小板。同时我们对F9基因进行了密码子优化，表达产生的两个FIX突变体都具有更高的比活性，可以增强FIX的比活性3倍以上。应用同样的基因治疗策略，我们也证明了可以在血小板中表达并储存凝血因子Xa（FXa），FXa也与VWF共定位且具有促凝血功能。该策略可以成为对于产生中和抗体的血友病患者的基因治疗方法。在安全性研究方面，我们建立了针对Rosa26位点的TALEN质粒系统，体外和体内试验证明了该系统可以有效地在Rosa26位点定点整合治疗基因，有望结合靶向血小板的基因治疗策略形成新一代更安全的基因治疗方法。