中文摘要：

基因治疗面临的基本问题是如何在保证有效性的前提下确保治疗的安全性。其中免疫原性风险和遗传安全性为其应用中首先需要解决的问题。在前期成功使用rep-RBE定点整合转基因方法通过小鼠尾静脉注射方法获得hFIX长时间表达的实验基础上，本研究使用自体细胞体外基因修饰避免免疫性问题,使用rep-RBE介导的定点整合转基因和体外整合标记初次筛选、非定点整合细胞自杀基因筛选和移植瘤实验等策略来避免遗传安全性问题,通过体外细胞无血清驯化和TAS等药物有限诱导延长转基因细胞生存时间、通过TAS Beads缓释技术获得移植细胞群hFIX较长时间高表达，从而建立一种安全可靠，可以反复使用的基因修饰体细胞治疗血友病的技术方法。在定点整合血友病模型动物完成有关临床前实验研究，可解决基因治疗血友病有关转基因细胞选择，安全性控制等应用基础问题。该项目有望推进基因治疗技术和理论的完善并提高血友病治疗水平。

结论摘要：

使用rep-RBE 介导的定点整合转基因和体外整合标记初次筛选、非定点整合细胞自杀基因筛选和移植瘤实验等策略来避免遗传安全性问题,通过体外细胞无血清驯化和TSA 等药物有限诱导延长转基因细胞生存时间、通过TSA Beads 缓释技术获得移植细胞群hFIX 较长时间高表达，从而建立一种安全可靠，可以反复使用的基因修饰体细胞治疗血友病的技术方法。在定点整合血友病模型动物完成有关临床前实验研究，可解决基因治疗血友病有关转基因细胞选择，安全性控制等应用基础问题。在实验研究中，构建了CMV-RBE-TK1-INS-CMV-Puromycin R-INS-Ubi- hFIXmini载体，在HK293验证其整合与表达特性，申请国家专利（一种pCMV-RBE-TK1-N2-EF1α-hFIXml质粒的构建和应用，20131033102X）。质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子IX的稳定细胞。特点为携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；正筛选基因可以用prumucin筛选获获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间，可以用阿昔洛韦去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。转染HEK293细胞发现其可以整合于AAVS1位点，切割RBE附近序列导致TK基因失去活性，而实现正负筛选目的。选择细胞系可以顺利表达有活性人类凝血因子9，表达量500ng/ml/24小时。建立小鼠原代成纤维细胞分离培养技术方法，体外成功维持100天。但是无法获得有效转染筛选满足临床前使用体外基因修饰细胞群。改用AAV和REP介导体内转基因系统，使用肝特异性启动子HCR-hAAT驱动hFIX表达。获得了240天以上以及1%有效水平以上hFIX表达，比使用CMV启动子获得较好的长期表达特性，提示潜在的应用价值。研究成果发表在JOURNAL OF CARDIOVASCULAR PHARMACOLOGY。专业学者R Jude Samulski和Clifford J. Steer分别在Expert Opinion on Orphan Drugs和LIVER TRANSPLANTATION正面评价该工作在孤儿药和肝靶向药研发中有积极意义。