中文摘要：

革兰氏阴性植物病原细菌编码产生的harpin蛋白是一类重要的激发子，模仿植物与病原菌的非亲和互作，诱发植物的气孔关闭和非寄主抗性。本项目应用反向遗传学技术，根据拟南芥不同组织的基因芯片信息，筛选在保卫细胞表达且丰度高的离子通道基因和MADS-box转录因子；通过构建上述候选基因的GFP融合蛋白，对其进行组织和亚细胞定位；进一步获得候选基因的拟南芥突变体，并分析突变体对激发子harpin诱发的气孔关闭的影响；进而结合生化分析来研究候选基因与Ca2+、H2O2和NO等第二信使在harpin诱发的气孔关闭中的关系；探讨harpin诱发的气孔关闭与诱导抗病性的关系；比较生物和非生物胁迫诱发的气孔关闭的异同。研究结果有助于阐明离子通道基因和MADS-box转录因子在激发子harpin诱发的气孔关闭和抗病性中的作用机制；筛选获得调控气孔关闭的基因可望为植物抗病育种研究提供新的抗病相关基因资源。

结论摘要：

为了比较不同来源的激发子诱发气孔关闭信号异同点，根据核盘菌Sclerotinia sclerotiorum角质酶SsCut基因，纯化得到其原核表达蛋白，分子量约20.4 KDa；SsCut激发子活性与温度、酸碱度无关，SsCut可以在较低浓度下诱发单子叶和双子叶植物的过敏反应和气孔关闭，伴随活性氧积累和抗病相关基因的表达，通过激活植物防卫相关酶，诱发植物对病原菌的抗性；药理学实验发现NADPH氧化酶介导的ROS和NO参与SsCut诱发的气孔关闭；角质酶活性位点突变发现SsCut激发子活性与角质酶活性无关，诱发植物免疫反应存在于角质酶的非酶活性区，可见SsCut可能作为一个新的PAMP (pathogen-associated molecular pattern) 诱发植物的非寄主抗性。采用病毒诱导基因沉默技术，发现一个新的MADS-box转录因子NbMADS1调控激发子harpin诱发的气孔关闭和植物免疫，而不参与致病疫霉INF1及稻瘟病菌Nep1诱发气孔关闭和植物免疫。NbMADS1沉默植株显著抑制harpin诱发的过敏反应、ROS和NO积累，而且沉默植株丧失harpin诱发的对寄生疫霉的抗病性。拟南芥MADS-box蛋白AGL14与本氏烟NbMADS1氨基酸相似性达到51.13%，拟南芥AtBHLH1蛋白在保卫细胞表达。agl14突变抑制harpin和SsCut诱发的气孔关闭，表明harpin和SsCut诱发的气孔关闭均依赖于AGL14；AtBHLH1突变抑制SsCut诱发的气孔关闭；agl14和AtBHLH1突变抑制SsCut诱发的ROS和NO积累，减弱SsCut诱发的对Pst DC3000病原菌抗性。表明NbMADS1、AGL14和AtBHLH1可能位于ROS和NO的上游，通过调节ROS和NO的积累调控harpin和SsCut诱发的气孔关闭，从而影响了激发子诱发的对病原菌的抗病性。综上所述，细菌激发子harpin和真菌激发子SsCut均可诱发植物过敏反应、气孔关闭和抗病性。转录因子调节ROS和NO的积累是激发子诱发气孔关闭中的普遍事件；不同来源的激发子通过相同或不同的转录因子激发气孔关闭。这些研究结果有助于揭示植物对病原菌的非寄主抗性分子机制，为不同激发子组装成多功能新型广谱性植物抗病诱导剂以及抗病基因工程的设计提供理论基础。