中文摘要：

应用现代分子生物学、蛋白质免疫印迹杂交、荧光实时定量PCR等先进手段研究中国近海典型赤潮生物在低磷营养条件和不同磷源培养下的碱性磷酸酶的表达水平，对典型赤潮生物在低磷营养和以有机磷为营养条件下的分子响应机制开展研究，并据此探索其与赤潮生物在赤潮爆发时占据生态优势两者之间的联系。以近年中国长江口海区最典型的赤潮生物－东海原甲藻、米氏凯伦藻、链状亚历山大藻和塔玛亚历山大藻作为主要研究对象。采用RACE技术，获得目标赤潮生物中碱性磷酸酶的全长cDNA编码基因序列，并以此为基础制备甲藻中碱性磷酸酶蛋白特异性抗体。设计目标赤潮生物在低磷营养和不同磷源培养下，采用荧光实时定量PCR技术和蛋白质免疫印迹杂交技术确定碱性磷酸酶基因的mRNA和蛋白表达水平对外界磷营养变化的响应。从分子水平上揭示目标赤潮生物对环境中磷营养盐变动的分子响应机制。

结论摘要：

浮游植物在环境中无机磷缺乏时，利用自身表达产生的碱性磷酸酶来水解环境中的有机磷而获得磷营养盐。在本项目之前，甲藻中碱性磷酸酶基因的鉴定以及诱导表达特性缺乏系统全面的研究。本项目基于阐释“甲藻中碱性磷酸酶基因的鉴定以及表达水平”这一科学问题，选取了多株代表性甲藻，开展了一系列根据甲藻碱性磷酸酶基因特性和表达水平的研究，同时开展了甲藻在磷限制下的分子生理生态研究。主要成果包括（1）成功地从15株甲藻（10个种）的gDNA和cDNA模板中获得碱性磷酸酶基因（AP）全长编码序列，涵盖裸甲藻目Gymnodiniales, 原甲藻目Prorocentrales, Suessiales 和膝沟藻目 Gonyaulacales。甲藻AP的基因结构具备多种特性，包括内含子，基因多态性和假基因化，结果表明基因复制是甲藻AP进化过程中主要的进化驱动力，符合Birth-and-death的进化模式。数据比对分析显示甲藻AP属于一类特殊的PhoAaty，并且这一类AP广泛存在于海洋微型浮游植物中。PhoAaty的序列存在大量可变区，但是同时保有四个保守域，结合模型预测分析，序列的两个特性具有潜在的重要生态含义，可变序列造成不同种类中的亚细胞分布特性，保守域氨基酸偏好表明酶活性所需的金属离子，表明甲藻可能通过表达不同类型的AP而具有独特的生态优势，并且酶蛋白的亚细胞分布多态性也表明其利用的有机磷来源可能存在差异。（2）实时定量PCR结果表明东海原甲藻和短凯伦藻中碱性磷酸酶基因的转录拷贝数均受到培养基中无机磷浓度的调节。采用免疫印迹杂交技术检测强壮前沟藻中不同无机磷培养条件下的AP蛋白表达，结果表明该蛋白的表达水平在无机磷限制下显著上调。（3）同时提取6种代表甲藻的细胞总蛋白开展了酶活性所需金属离子的初步研究，结果显示其酶活性所需金属离子可能为钙离子。（4）以亚历山大藻为研究对象，采用抑制差减杂交技术获得其在磷限制条件下的差异基因表达谱并检测基因表达差异，流式细胞技术分析了东海原甲藻磷限制条件下细胞周期停滞于G1期的特性。该项目创新性地对甲藻的碱性磷酸酶基因的结构和系统进化开展了分析，并深入探讨了其潜在的生态含义，更全面地探讨甲藻的磷营养利用和生态适应机制。已在Frontiers in Microbiology, Harmful Algae和PLoS ONE等SCI杂志上发表论文11篇。